[发明专利]一种sgRNA片段及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因修饰技术领域，具体涉及一种sgRNA片段及其应用。 

背景技术

目前市场上同样能达到myod1基因编辑修饰的产品有ZFN靶点识别模块以及TALE靶点识别模块，都是依靠ZFN靶点识别模块以及TALE靶点识别模块特异识别一段DNA序列，并利用Foki核酸酶对双链DNA进行切割，造成DNA断裂后可以启动细胞对DNA的修复，从而实现特定位点的基因操作如基因敲除、基因敲进、基因突变及基因修复等。 

ZFNs(zinc-finger nucleases，ZFNs)曾被认为是最有潜力的基因改造技术，它实现了基因的靶向操作，并得到了广泛的应用。ZFNs的DNA识别域是由一系列锌指蛋白模块串联组成，每个锌指蛋白模块识别并结合DNA链上一个特异的三联体碱基，将目的基因对应的一系列锌指蛋白模块串联在一起即可特异性识别目的基因。然而从商业公司获得高效的ZFNs需要支付高昂的费用，从锌指核酶委员会及Addgene上获得的ZF模块质粒，自行组装针对特定DNA序列的ZFNs，所需的工作量大，花费也十分昂贵，而且最终产生的ZFNs在细胞内会产生细胞毒性，因此有必要发展更为高效的基因定点修饰技术。 

TALEs(transcription activator-like effectors，TALEs)被认为是ZFNs的替代者，TAL的核酸识别单元为间隔32个恒定氨基酸序列的双连氨基酸，双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系。因此，欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元串联克隆即可，TALE蛋白DNA序列识别结构域能够识别单个碱基对的特性要比锌指蛋白的3碱基识别更富灵活性，在设计的时候可变性更强，它的出现提高了模块蛋白识别DNA链的特异性，可构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶。但是它也是基于蛋白识别碱基序列，工作量较大。 

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种sgRNA片段。 

本发明的另一个目的是提供一种含有sgRNA片段的表达载体。 

本发明的又一个目的是提供一种基因定点改造方法。 

本发明的又一个目的是提供一种基因打靶试剂盒。 

技术方案：为了解决上述问题，基于对CRISPR/Cas系统的研究，CRISPR/Cas系统是通过RNA介导的DNA内切酶进行基因组编辑操作，它们就是CRISPR RNA(crRNA)和反式作用CRISPR RNA（trans-acting CRISPR RNA,tracrRNA)。这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。向导RNA包括一段20bp左右的DNA识别区与一段固定序列，其DNA识别区与靶位点处碱基互补，引导Cas9蛋白在结合区随机剪切DNA双链，随后Cas9自行脱落，形成DSB（Double Stranded Breaks）缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制（non-homologous end joining,NHEJ）修复目的基因双链。在修复的过程中易形成移码突变，导致靶位点处基因失去功能。若同时转入基因修饰过的目的基因片段，可靶向定点敲除、插入、突变、修复相应碱基位点。 

本发明的技术方案是：一种sgRNA片段，所述sgRNA片段的DNA序列包括一段固定序列和一段DNA识别序列，其中，所述DNA识别序列是可与目的基因两条链中的一条链碱基互补的DNA序列，所述固定序列为 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT。所述固定序列如SEQ ID NO.1所示。 

其中，上述sgRNA片段的DNA序列具有如下结构：5’Xy-NGG-固定序列-3’，其中X代表A、T、C、G四个碱基中任意一个，y代表DNA识别序列长度，长度为19-21bp。 

其中，上述DNA识别序列其碱基序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.343。