[发明专利]单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及测定方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检验领域，尤其是涉及一种单管联合测定乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因与亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因突变位点的试剂盒和方法。该技术可应用到临床的检测，流行病学的筛查以及种群基因组差异的研究。尤其是其可应用于临床体检与药物基因组学检测。 

背景技术

随着高通量测序的普及以及人类基因组计划的完成，个体化诊疗技术正逐步迈向日常临床诊断与治疗工作，并正逐渐影响着临床诊疗思维和个人健康管理的方式。单核苷酸多态性分析（SNP）是个体化诊疗的重要组成部分，目前主要应用于患者的药物基因组学检测中，对患者的用药剂量与用药周期进行指导。实际上，SNP分析不仅仅能作为有效的药物基因组学标志物，其亦可作为一种优良的疾病筛查与防治标志物在体检中进行应用。 

1、ALDH2基因的临床研究进展 

乙醛脱氢酶ALDH是酒精代谢中将乙醛转化为乙酸的关键酶，位于12号染色体的ALDH2基因是线粒体乙醛脱氢酶的主要编码基因。当ALDH2基因发生错意SNP突变时，其编码合成的ALDH酶活性将发生不同程度的降低。ALDH酶活性的降低将引起机体对乙醛代谢能力的下降，导致大量摄入酒精后血清乙醛浓度的急剧升高，最终导致对肝脏功能的急性损害，并与肝脏、胃、食管等消化系统癌症的发生相关^[1-4]。同时，ALDH酶已被证明在重要的急性心血管药物——硝酸甘油的代谢活化通路中扮演着重要的角色，其活性的降低乃至丧失将引起硝酸甘油的疗效降低甚至完全失效^[5]。根据美国国立生物信息技术中心NCBI数据库的数据，ALDH2基因的Glu504Lys突变在中国人群中所占比例高达30%，为中国人群最常见的ALDH2点突变。近年来研究^[6,7]还表明，该突变可能与汉族人群中的二型糖尿病和冠心病的发病相关。 

2、MTHFR基因的临床研究进展 

亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR是叶酸代谢中的关键酶之一，可将还原型辅酶I(NADPH)相关的5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸。前者生物学作用为细胞内一碳基团的 传递体，参与嘌呤和嘧啶的合成及DNA修复过程；而5-甲基四氢叶酸作为甲基供体，在甲硫氨酸合成酶的催化下将甲基基团提供给同型半胱氨酸生成蛋氨酸，并进一步复甲基化为S-腺苷甲硫氨酸，而参与体内广泛的甲基化反应。当MTHFR基因发生SNP错意突变时，其活性下降将导致体内叶酸代谢过程障碍从而引发多种疾病，包括导致唐氏综合征风险增高和新生儿发育异常^[8-10]，伴高同型半胱氨酸血症的梗阻性脑卒中^[11]，还与深静脉血栓的发生密切相关^[12]。根据美国国立生物信息技术中心NCBI数据库的数据，MTHFR基因的C677T单核苷酸SNP多态性在中国人群中最为普遍，汉族人口携带者比率约为27%-46%。 

3、焦磷酸测序方法学的优点 

目前，对于单核苷酸多态性SNP的检测技术主要包括基于等位基因特异性杂交的Taqman探针技术，分子信标技术等;基于核酸内切酶的限制性长度多态性技术，引物入侵分析技术等;基于高度特异性DNA连接酶的寡核苷酸连接分析技术;基于引物延伸的直接测序法和等位基因特异性延伸法等。但这些方法大多操作复杂，成本昂贵，因而没有在大规模SNP检测中得到应用。焦磷酸测序法由于其良好的定量性能，无需电泳或荧光标记，易于自动化等优点已成为SNP检测最主要的方法。但是，由于以往的焦磷酸测序中各个位点的扩增反应需要单独进行，这意味着需要检测的项目有几个突变位点，则需要相应数量的扩增反应。这无形中大大的提高了焦磷酸测序检测作为临床检测的成本和价格，被动地将大量需要进行该检测的患者拒之门外。本发明将ALDH2基因与MTHFR基因两个突变点进行单管的多位点扩增反应进行焦磷酸测序的检测，降低了检测的成本、简化了技术流程，从而降低了检测的费用与成本，降低了个体化医学的门槛。 

参考文献： 

1、阎明朱孔锡孟繁立王红娟吴美玲.乙醛脱氢酶基因多态性与酒精性肝病的关系.中华肝脏病杂志，2003，11（11）：654-656。 

2、丁建华,李苏平,吴建中,周建农,高长明,周学富,丁保国,王如鸿.乙醛脱氢酶2与饮酒和HBsAg致肝癌交互作用.中国公共卫生,2003,19(3):260-262。 

3、杨玉凤,沈孝兵,张娇.乙醛脱氢酶2基因多态性及环境暴露与胃癌易感性.中国公共卫生,2006,22(4):435-436。