[发明专利]用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检验领域，涉及华法林，尤其涉及一种用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法。

背景技术

华法林是一种双香豆素衍生物，华法林通过抑制维生素K及其2，3-环氧化物(维生素K环氧化物)的相互转化而发挥抗凝作用。虽为最古老的口服抗凝药物，华法林仍然是目前需要长期抗凝治疗患者的最常用药物^[1]。华法林的临床应用包括静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的一级和二级预防、心房颤动(房颤)血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成的预防等^[2,3]。非瓣膜病房颤研究荟萃分析显示，华法林可使卒中的相对危险度降低64％，全因死亡率显著降低26％^[4]。但是，华法林临床应用存在有效血药浓度范围狭窄和个体间稳定剂量差异显著（不同患者个体间剂量差异可达数十倍）两大问题。这两个问题直接导致出血或血栓形成等副作用的发生：在美国，华法林的致死性副反应一度居所有药物之首^[5]。

造成华法林个体剂量差异的原因包括非遗传因素和遗传因素。非遗传因素主要指身高、年龄、体重、饮食、药物相互作用等，非遗传因素是华法林用药剂量差异的次要原因。遗传因素是影响华法林个体剂量差异的关键因素。其中最重要的遗传因素为与华法林药效动力学和药代动力学相关的酶或靶蛋白的基因发生变异导致此关键酶或靶蛋白的含量或活性的变化，进而增强或降低华法林的敏感性，影响到华法林的剂量。

华法林代谢的关键酶为细胞色素P450超家族的第二亚家族的CYP2C9蛋白，该酶将华法林代谢为无活性成分，并且已知CYP2C9基因单核苷酸多态性对华法林用药剂量的个体差异有显著影响^[6]。CYP2C9包含CYP2C9*1—CYP2C9*15等多种基因型，而其中的CYP2C9*2（rs1799853）和CYP2C9*3（rs1057910）基因型对华法林代谢影响最大。例如，CYP2C9*3的1075A>C突变导致该酶359位氨基酸由异亮氨酸变为亮氨酸，酶活性失活（突变型酶活性仅为野生型5%），导致华法林的清除率低于正常，血药浓度升高。因此，此类人群需要降低临床用药剂量，以防止药物过量导致的出血等不良反应的发生。华法林作用的靶蛋白为维生素K还原酶复合物（VKORC），该酶正常的生理功能为将环氧化形式的维生素K转化为氢醌形式，后者则在维生素K依赖的凝血因子FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ活化中起重要作用。同样的，编码VKORC蛋白的VKORC1基因的SNP多态性也会导致VKORC酶的活性改变，进而影响到华法林的抗凝效果，并且在亚洲人群VKORC1对华法林剂量的影响更为重要，可达16—30%^[7]。其中又以VKORC1基因启动子区-1639G>A（rs9923231，也被称为VKORC1*2基因型）最为重要，G基因型比A基因型的酶活性高40%，因此A基因型突变时华法林剂量较G基因型要低。

可见CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因多态性是影响华法林个体剂量差异的主要因素。而且基于这些基因多态性位点的检测以分层用药剂量或联合患者的身高、体重等信息做的剂量预测方程预测具体剂量以在有检测条件的发达国家和地区应用，并表现了优于传统固定剂量给药方式的高疗效和低副作用^[8,9]。目前检测上述华法林个体化剂量相关基因多态性的方法较多，包括实时荧光PCR法、限制性内切酶片段多态性分析（RFLP）、基因芯片、Sanger测序法、普通PCR联合电泳分析等等，但是这些方法存在灵敏度不够、耗时、交叉污染和成本昂贵等问题。

焦磷酸测序技术是基于实时反应、边合成边测序的新型核酸序列分析技术，该技术具有操作简便、检测成本较低、快捷、准确、可高通量，同时也无需荧光标记和电泳分析等操作，非常适合临床检验的用途。本发明即是基于焦磷酸测序技术进行华法林个体化治疗剂量相关基因多态性检测试剂盒的开发和应用。

参考文献：

1、中华医学会心血管病学分会，中国老年学学会心脑血管病专业委员会.华法林抗凝治疗的中国专家共识.中华内科学杂志.2013;52:76-82.