[发明专利]一种纳豆激酶高效表达的方法及其用途

权利要求书

1.一种纳豆激酶高效表达的方法，其特征在于：纳豆激酶高效表达的方法是，运用基因工程技术构建高效表达质粒，优化工程菌发酵条件实现纳豆激酶的低成本、高活性、高产量生产，用PCR的方法从分泌纳豆激酶的枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增得到全长为1056bp的前导肽+成熟肽纳豆激酶原基因，构建重组表达质粒pBE2S-Pro-NK，转化重组质粒到枯草芽孢杆菌WB600菌株后取培养液，用硫酸铵分级沉淀法纯化分泌到培养液中的纳豆激酶，经聚丙烯酰铵凝胶电泳SDS-PAGE成单一条带，经纤维平板法检测出现透明圈，得到有活性的纯度较高的纳豆激酶。

2.根据权利要求1所述的纳豆激酶高效表达的方法，其特征在于使用pBE2S质粒为分泌型载体，WB600为枯草芽孢杆菌6种分泌蛋白缺陷菌株，有利于纳豆激酶的纯化，并且枯草芽孢杆菌为生物安全菌株。

3.根据权利要求1所述的纳豆激酶高效表达的方法，其用途在于：用带P43强启动子的穿梭质粒克隆aprN基因，成功转入枯草芽孢杆菌 WB600株，其大多数胞外蛋白酶基因已经敲除，既可以防止其他蛋白酶对纳豆激酶蛋白的降解，也可以提高纳豆激酶产品纯度，P43是一个重叠启动子，分别在对数期和稳定期启动转录，P43 大致比纳豆激酶基因自身的启动子强10倍，后者的转录受群体感应系统调节，只在特定阶段表达，纳豆激酶同类产品是从纳豆中提取，纳豆激酶含量和纯度都不高；成功nattokinase的表达及其活性检测； 成功利用蛋白提取及纯化手段提纯活性高的nattokinase ；提出将纯化的高活性nattokinase投入实际应用，生产纳豆激酶肠溶片、胶囊，进一步开发注射针剂。