[发明专利]一对靶向绵羊DKK2基因的sgRNA

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一对靶向识别绵羊DKK2基因的sgRNA及其应用。

背景技术

ZFN和TALEN打靶技术是目前研究较为成熟的两种定点突变技术，但是这两种技术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶。而CRISPR/Cas9系统对特异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有一系列的crRNA组成，每个针对特异位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建(CRISPR/Cas9新型基因打靶系统的研究进展.江苏农业学报.李辉等，2013)。

(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等(Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.Science.2013)及Mali等(RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013)证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。但是，随后的研究表明，Cas9存在较为明显的脱靶效应(High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.Nature Biotechnology.Fu et al，2013；High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9nuclease specificity.Nature Biotechnology.Pattanayak et al，2013)。麻省理工学院Feng Zhang团队使用双切刻技术将Cas9的特异性提高了50倍以上(Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9for enhanced genome editing specificity.Cell.Ran et al，2013)，维护了Cas9在基因打靶技术领域的地位。借助于这一技术，动植物基因功能研究及育种等等都将得到迅猛的发展。

DKK基因家族是WNT信号通路的抑制因子，而WNT信号转导调控毛囊的生长发育。DKK2是DKK基因家族的重要成员。DKK2的高度过表达导致小鼠几乎无毛；DKK2相对较低水平的过表达，小鼠被毛出现，但是结构异常(Wnt and dkk determine hair follicle spacing through a reaction-diffusion mechanism.Science.Sick et al，2006)。Foxnl：：Dkk2中度过表达小鼠，单位面积的毛囊数量下降了30％，毛囊呈束状排布。Sick等使用反应-扩散模型还预测，DKK的表达量下降或降解加速会导致毛囊间距降低(Wnt and dkk determine hair follicle spacing through a reaction-diffusion mechanism.Science.Sick et al，2006)。与这一预测相一致的是，抑制BMP信号导致毛囊密度增加(Makin gwaves with hairs.J Invest Dermatol.Plikus et al，2004)，而抑制BMP可能降低DKK2表达(The Wnt antagonist Dickkopf-1is regulated by Bmp signaling and c-Jun and modulates programmed cell death.EMBO J.Grotewold et al，2002)。

由此可见，DKK2是细毛羊育种的重要候选基因。在细胞或个体水平上对绵羊DKK2基因进行敲除或修饰，可解析绵羊DKK2基因的功能，为细毛羊的羊毛细度育种服务。

发明内容