[发明专利]抑制Grb2基因表达的siRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体为一种高效抑制生长因子受体结合蛋白2(Growth factor receptor-bound protein2，Grb2)基因表达的siRNA及其在抗71型肠道病毒(enterovirus71，EV71)药物方面的应用。

背景技术

手足口病自1974年首次报道以来，1975，1978，1997和1998年分别在保加利亚，匈牙利，马来西亚和台湾等国家和地区引起了不同程度的爆发，涉及数十人死亡。2008年3月在我国安徽省阜阳地区开始爆发手足口病疫情，导致23人死亡，3000多人感染。之后，在北京、上海、浙江、广东等地区也相继有EV71感染的报道，到2008年底，中国手足口病感染人数累计达48.9万多，而且死亡人数为126人。2009年继河南省明泉县报道手足口病感染并有10例病人死亡后，相继在山东、北京、四川、广西、云南、甘肃、贵州等多个省市流行，患病人数和死亡人数超过了2008年(将近两倍)。仅2010年上半年，中国有500多人死于手足口病。根据世界卫生组织报道，2013年，截至11月中国死于手足口病的死亡人数达569人。

从这几年的情况看，我国每隔几年就有局部爆发，患者人数多，分布广，大部分还在不发达地区，给国家和人民带来了巨大损失，同时也影响着国家的经济和社会安全。手足口病等流行性疾病成为了民众关注的焦点，有效的控制疫情对国家和社会都有着重要的意义。正因如此，2009年开始卫生部已经将其列入法定丙级传染病，以更好的监控疫情，为防控和治疗提供必要的资料和信息。

手足口病的主要病原体有71型肠道病毒(Enterovirus71，EV71)、柯沙奇病毒A16(Coxsackieviruses A16，CAV16)等，但是引起神经性症状和死亡的主要是EV71。

EV71是1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的。它属于微小病毒科(Picornaviridae)中的肠病毒群(Enterovirus)。微小病毒科的病毒包括很多引起人和动物疾病的病毒如口蹄疫病毒、肠道病毒以及引起肝炎的甲型肝炎病毒(HAV或者EV72)。其中肠病毒属的病毒包括脊髓灰质炎病毒(Polioviruses；具3种型别)、柯沙奇病毒(A型23种型别、B型具6种型别)、埃可病毒(Echoviruses；具31种型别)及肠病毒(Enteroviruses68～72型)。

目前针对EV71病毒的药物开发主要集中于病毒自身的蛋白。由于EV71病毒在传播过程中往往会出现基因型的转变，从而有可能产生耐药性。而EV71的侵染是病毒和宿主细胞互作的结果，病毒需要宿主提供侵入，脱壳，复制，表达和组装等细胞因子。可以说，阻断这些细胞因子，将从根本上解决与EV71相关的医学问题。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。而随着RNAi作为制药技术的日趋成熟，已有siRNA药物进入临床实验，siRNA药物具有如下优点：1)特异性强，完全配对的碱基序列决定了其高特异性；2)设计便利，人类基因组测序早已完成，这为siRNA的设计应用带来了极大的便利；3)临床便利，作为核酸类药物，siRNA药物具有相似的药物代谢，药物毒性和药物分布；4)由于RNAi是针对特定基因，所以其药理学途径明确。

我们经过对与EV71侵染有关的宿主基因的筛选研究后，进一步挑选Grb2作为可能性的靶标基因，利用siRNA技术，结合分子生物学和细胞生物学手段对其在EV71的侵染，增殖等过程中的功能进行分析，为EV71的治疗提供可行性药物。

发明内容

本发明的目的在于获得高效抑制Grb2基因表达的siRNA，并进行临床应用。

本发明利用RNAi技术，根据siRNA的设计原理，对靶标基因Grb2设计并合成5条siRNA，将这5条siRNA转染至横纹肌肉瘤细胞(Rhabdomyosarcoma，RD)细胞进行基因沉默效用的评定之后，将能够最高效抑制Grb2基因表达的siRNA转染至RD细胞后，通过EV71侵染检测该siRNA抵抗EV71侵染的效果，证明其在临床上应用的可行性。

具体来说分为以下几步：