[发明专利]桑椹白藜芦醇合成酶基因的克隆和植物表达载体的构建

说明书

技术领域

本发明涉及一种白藜芦醇合成酶（resveratrol synthase，RS）基因的克隆和植物表达载体的构建，具体为桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS）的克隆。

背景技术

白藜芦醇合成酶是植物体内白藜芦醇（resveratrol，Res）生物合成途径的关键酶。白藜芦醇合成酶能够催化苯丙氨酸代谢途径中的反式香豆酸-COA和丙二酰-COA结合，形成白藜芦醇。

白藜芦醇化学名为3,4,5-三羟基芪，是多羟基芪类化合物，该物质多存在于植物的木质部。目前在21科、31属、72种植物中发现了Res，如葡萄科的葡萄属、蛇葡萄属，豆科的落花生属、决明属，蓼科的蓼属等。存在该物质的植物多为常见的药用植物，如决明、藜芦、虎杖等，也有部分为食物，如葡萄、花生、桑椹等。

近年来发现Res具有抗肿瘤作用，它对胃肠道癌、生殖器官癌、皮肤癌等多种癌症都有不同程度的拮抗作用。Res的抗癌机理还未得到统一认识，普遍认为其对肿瘤细胞的起始、增殖和发展三个阶段都有影响。即：通过抗氧化、抗突变、诱导二期药代酶的作用发挥抗起始活性；通过抗炎、抑制环加氧酶和氢过氧化物酶的活性在肿瘤的促进阶段起抑制作用；诱导人早幼粒白血病细胞的分化而抑制肿瘤的发展。廖纪元等通过研究白黎芦醇诱导宫颈癌细胞株Hela的细胞生长和发育的改变，以及细胞周期的进行和凋亡等，结果显示，Res作用后，Hela细胞的增殖速度减慢，DNA合成减少。

“法国悖论”的出现让人们发现了Res对心血管保护的重要作用，如今该方面已经成为研究热点。Res具有抗心血管疾病的作用，它可以通过增加一氧化氮合酶的表达，增加NO含量，从而激活鸟苷酸环化酶（GC），提高环磷酸鸟苷水平，发挥保护作用；其次，白藜芦醇具有抗氧化、清除自由基及抗脂质过氧化作用，进一步发挥对心血管的保护功能；第三，白藜芦醇对血管有广泛的舒张效应等。

同时，人们进一步研究发现，白藜芦醇对于防辐射、脑和神经的保护、延缓衰老、延长寿命以及预防老年痴呆等均有一定的作用，白藜芦醇已经成为仅次于紫杉醇的第二大受人们高度关注的天然药物。

白藜芦醇是植物免遭外在环境包括微生物等刺激的代谢产物。当植物受到病原菌的侵染时，赤松素、白藜芦醇、四羟反式芪等植保素在植物体内的合成明显增加。白藜芦醇能抑制植物病原真菌菌丝的生长及孢子的萌发，是植物在抵御生物或非生物胁迫中产生的植物保护素。实验已经证实白藜芦醇能够抑制葡萄上病原真菌的生长，如灰霉菌、根霉菌以及拟垄点霉。Liu等克隆的廖属植物STS基因转化到拟南芥中进行表达，通过HPLC，HPLC-ESI-MS等检测，发现在拟南芥中表达了一个反式-白藜芦醇苷，其表达产物能抑制炭疽病病原体次盘孢（Colletotrichum higginsianum）的孢子产生，从而抑制该病菌，由此可见该基因可以加强作物的抗病原菌性和品质。

目前，Res在医学上已经有了广泛的应用，人们对Res产量的需求也越来越大，然而，Res虽来源广泛，但植物中含量非常低，化学合成虽条件成熟但有一定的限制性。现代分子生物学研究手段的发展，使得多种芪合酶基因被陆续分离鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产白藜芦醇及其衍生物开辟了道路。

桑椹是桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）的多年生木本植物桑树（Morus alba L.）的果实，其中含有多种功能性成分，如芦丁、花青素、白黎芦醇等，具有良好的防癌、抗衰老、抗溃疡、抗病毒等作用。目前，从葡萄、花生、虎杖等植物中已克隆到白藜芦醇合成酶基因，但未见以桑椹为材料克隆白藜芦醇合成酶基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种桑椹白藜芦醇合成酶基因，并构建了该基因的植物表达载体。通过提取新鲜桑椹总RNA，用同源克隆和RACE技术克隆了桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS），得到完整的基因序列为1496bp。构建了植物表达载体pCAMBIA2300-MaRS-Kana应用烟草表达系统，对克隆的MaRS基因功能进行了验证，MaRS基因能够在烟草中正常表达，产生白藜芦醇及其衍生物。

本发明的第二个目的是提供桑椹白藜芦醇合成酶基因编码的蛋白质。 

本发明的第三个目的是提供带有桑椹白藜芦醇合成酶基因的具有3种不同筛选标记的植物表达载体。

本发明提供了一种桑椹白藜芦醇合成酶基因（MaRS），如序列表SEQ ID NO.7中所示的核苷酸序列。