[发明专利]一种用于蛋白质标记的水溶性近红外荧光探针及合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物大分子标记，更具体涉及用于蛋白质标记的水溶性近红外荧光探针。 

背景技术

多甲川花菁类染料的吸收和发射光谱在近红外的500-1200nm处，可以有效地过滤生物体内的背景荧光，提高检测的信噪比。多甲川花菁类染料具有摩尔吸光系数高、吸收发射范围可调等特点，在生物大分子研究中得到广泛的应用。 

花菁类染料在生物大分子标记的中的应用越来越广泛，在激发波长在600-700nm的荧光探针的商业化产品也越来越多，如GE公司的Cy5-NHS-ester、Cy5 Maleimide等产品，然而这些产品水溶性较差，不利于对水溶液中的大分子进行标记，且连接的碳链较长，其较大的柔性不利于对生物大分子的结构和动态学特征进行精确地描述。而Alexei Toutchkine等人发展了Cy5.2-IA、neo-Cy5、I-SO-IAA等一系列的化合物如下式所示，虽具有较好的水溶性，但是由于其合成的成本昂贵，前体合成步骤复杂且涉及到浓硫酸浓硝酸等危险品，影响了其推广。 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于蛋白质标记的水溶性近红外荧光探针，该探针将吲哚五甲川花菁素类的化合物引入了亲水性的磺酸基团，提高了水溶性；减少了连接位点与荧光基团的距离，提高了探针的刚性；从而解决了目前蛋白质荧光探针水溶性差、连接基团较长的问题。 

本发明的另一目的是提供一种上述探针的合成方法，该方法在合成过程中不使用浓硫酸、浓硝酸等危险管控试剂。 

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种用于蛋白质标记的水溶性近红外荧光探针，该探针的结构如下式所示： 

上述一种用于蛋白质标记的水溶性近红外荧光探针的合成方法分为两步，第一步反应一是将1.2-1.5当量的化合物I和1当量的化合物II在1.5-3.5当量的氯乙酸酐和1.5-3.5当量的醋酸盐在有机溶剂1中室温搅拌0.5-1.5小时，得到中间产物III；第二步反应二是将1当量的中间产物III与1.1-1.5当量的碘盐在有机溶剂2中加热至40-70℃回流12-24小时，得到目标产物IV，即水溶性近红外荧光探针；如下式所示： 

所述的化合物I结构中，对应的阳离子为钾离子或钠离子，R=H、-COCH₃

所述的化合物II结构中，X=Cl，Br，其对应的阳离子为钾离子或钠离子； 

所述的有机溶剂1为N，N-二甲基甲酰胺、乙腈或者氯仿； 

所述的有机溶剂2为甲醇与氯仿的混合溶剂或者甲醇与二氯甲烷的混合溶剂； 

所述的碘盐为碘化钾或者碘化钠； 

所述的醋酸盐为醋酸钾或者醋酸钠。 

本发明的优点是：本发明的探针将吲哚五甲川花菁素类的化合物引入了亲水性的磺酸基团，提高了水溶性；减少了连接位点与荧光基团的距离，提高了探针的刚性；从而解决了目前蛋白质荧光探针水溶性差、连接基团较长的问题。由于激发和发射光谱位于近红外区域，作为一种蛋白质定点标记的探针，可以有效降低背景荧光干扰，提高信噪比。同时，该荧光探针的柔性较小，有利于对生物大分子的结构和动态学特征的精确描述。本发明探针的合成方法在合成过程中不使用浓硫酸、浓硝酸等危险管控试剂，减少了合成过程中的危险性，易于推广应用。 

附图说明

图1为本发明的一种用于蛋白质标记的水溶性近红外荧光探针与Ub-LBT-CW蛋白在pH=7.420mMHEPES的体系在4℃混合12小时后，过脱盐柱除去小分子后收集的Ub-LBT-CW的蛋白的激发发射 图谱。 

其中：虚线表示激发光谱，实线表示发射光谱。激发波长为：649nm发射波长为：667nm。说明本发明的荧光探针已经成功连接到了蛋白上。 

具体实施方式

以下结合附图，对本发明作进一步的说明。 

一种标记蛋白质并用于荧光光谱研究的花菁染料探针,该花菁染料探针的分子结构如下： 

如下式所示，上述探针通过1.2-1.5当量的化合物I和1当量的化合物II，在1.5-3.5当量的氯乙酸酐和1.5-3.5当量的醋酸盐的有机溶剂1中室温搅拌0.5-1.5小时，柱层析分离得到对应的中间体化合物III；再用1当量的化合物III与1.1-1.5当量的碘盐在有机溶剂2中40-70℃下回流12-24小时得到最终产物化合物IV。