[发明专利]一种灵芝多糖高产工程菌株Rmust及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和代谢工程领域的，具体涉及一种通过基因工程对灵芝代谢途径中有关灵芝多糖合成的PGM（葡萄糖磷酸变位酶）基因过表达的方法，构建了一个灵芝多糖的高产工程菌株。

背景技术

灵芝( Ganodermalucidum ) 是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌。灵芝真菌在我国有20多种，包括赤芝，黄芝，紫芝，黑芝，薄盖灵芝，树舌等。我国应用灵芝作为药物已有两千多年的历史。灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。由于其特殊的要用价值，灵芝的有效成分分析和药理学研究已经引起了国际上的广泛关注，尤其在日本，美国，韩国等国家。目前，灵芝的研究已经深入到了分子水平，一些专著相继出版，从不同的角度介绍了灵芝的生物学特性、栽培技术、药理学作用及临床应用等情况。

灵芝多糖是从灵芝中提取的一种新内源活性物质，其所含的化学成分能够显著提高吞噬细胞的吞噬能力，增强体液免疫和细胞免疫功能，还能提高红细胞中超氧化物歧化酶活性，对人体具有多种功能。

PGM（葡萄糖磷酸变位酶）基因是灵芝多糖合成途径中的一个较为关键的基因，它能使糖原分子的葡萄糖残基形成的葡萄糖-6-磷酸转变为葡萄糖-1-磷酸。葡萄糖-6-磷酸是糖酵解或糖原合成的主流中间代谢产物，在细胞中的代谢比较快，但是只有葡萄糖-1-磷酸才能够合成多糖，因此PGM对糖原的合成具有重要的作用。灵芝多糖的合成途径如下所示：

随着人们生活水平的提高，各种癌症等疾病的发生率也逐年递增。于是，人们对健康的关注也越来越来广泛。灵芝作为一种良好的中药对提高人体免疫力，抗氧化等方面具有重要的地位，尤其是在治疗癌症方面表现尤为突出。

虽然灵芝在治疗癌症方面具有不可替代的作用，尤其是野生灵芝效果更佳，但是野生灵芝资源有限。随着对灵芝的需求不断增加，如何提高灵芝的产量和增加灵芝的有效成分越来越引起人们的关注。液体深层发酵技术是进行快速工业化生产的重要手段。现在市售的灵芝多糖主要从灵芝子实体和液体深层发酵得到的菌丝体中获得。但是液体深层发酵方法投资大，干燥费用高，产品得率低。灵芝多糖在灵芝细胞中的含量低，分离纯化也较难，这限制了灵芝多糖的活性及作用机理的研究及广泛应用。近年来，基因工程与代谢工程迅速发展，成为了现代分子育种的重要手段。通过分子克隆和基因拼接等分子生物学方法来改造菌株的基因组，从而提高活性成分的含量越来越受学者们的青睐。如何从分子水平上提高灵芝多糖的产量是目前急需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是解决野生型灵芝菌株自身产灵芝多糖较低的问题，提供一种灵芝多糖高产菌株，该菌株为高产灵芝多糖的灵芝（Ganoderma lucidum）工程菌Rmust，已于2013年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.8258。

本发明灵芝多糖高产工程菌株的构建方法如下：

以PMD19-T为起始载体并使用灵芝本身的强启动子P-gpd、终止子T-sdhB、cbx基因，cbx基因（具有carboxin抗性）是来自灵芝本身的琥珀酸脱氢酶基因进行定点突变后获得的抗性基因，其特点是在蘑菇类担子菌的转化体系中同源标记基因的转化效率更高，能够稳定遗传，抗性强；

1、将灵芝启动子P-gpd与终止子T-sdhB与PMD19-T连接，将灵芝cbx抗性基因插入到Pst I酶切位点，从而构建成pJW-EXP载体；其具有灵芝的强启动子和终止子，并具有灵芝本身的抗性；

其中扩增灵芝强启动子P-gpd的引物序列为：

P-gpd-F：5’-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3’ ，

P-gpd-R：5’-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG- 3’；

扩增灵芝sdhB基因终止子的引物序列为：

T-sdhB-F: 5’-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3’，

T-sdhB-R : 5’-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3’；

扩增灵芝cbx抗性基因的引物为：