[发明专利]犬瘟热和犬冠状病毒双重PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种犬瘟热和犬冠状病毒双重PCR检测试剂盒，其特征是:它包括Mix PCR反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中: 所述Mix PCR反应液管由以下反应液组成: 

序列为SEQ ID N0.1的10 mmol/L的上游引物0.5 μ L ； 

序列为SEQ ID N0.2的10 mmol/L的下游引物0.5 μ L ； 

序列为SEQ ID N0.3的10 mmol/L的上游引物0.5 μ L ； 

序列为SEQ ID N0.4的10 mmol/L的下游引物0.5 μ L ； 

10XPCR buffer 缓冲液 2.5 μ L ； 

25 mmol/L MgCl2 2 μ L ； 

10 mmol/L dNTP 1 μ L ； 

5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0.3 μ L ； 

灭菌水14.2 μ L ； 合计22 μ L,为单次反应的用量； 

所述阳性对照管:管内为犬瘟热病毒和犬冠状病毒各自的重组质粒，比例为1:1，2 μ L?20 μ L，其DNA.序列如下: 

   犬瘟热病毒重组质粒PMD18-T-CDV的DNA序列为SEQ ID N0.5 ；

   犬冠状病毒重组质粒PMD18-T-CCV的DNA序列为SEQ ID N0.6 ； 

   所述阴性对照管:管内为无犬瘟热病毒和犬冠状病毒感染的犬肌肉组织DNA样品，2 μ L   

   ?20 μ L ; 所述灭菌去离子水管:1?2mL。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征是: 所述犬瘟热病毒和犬冠状病毒在同一PCR反应体系中进行特异性扩增，根据扩增片段的大小，将犬瘟热病毒和犬冠状病毒鉴别与区分。

3.一种采用权利要求1所述试剂盒用于的犬瘟热和犬冠状病毒双重PCR疾病诊断目的的检测方法，步骤如下: 

    (1)制备待测样品核酸模板 取100 μ L?200 μ L或100mg?200mg待检样品，用商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取待检样品中的基因组DNA，即为待测样品核酸模板； 

    (2)PCR扩增检测:取3 μ L待测样品核酸模板和阴性对照管，或3 μ L待测样品核酸模板和阳性对照管，分别用Mix PCR反应液管进行PCR扩增； PCR扩增条件是: 预变性:95 °C 5分钟； 循环:94 °C变性45秒，58 °C退火30秒，72°C延伸45秒，35个循环； 延伸72 °C 10分钟； 

    (3)结果判定:在550 bp和225 bp位置有两条扩增条带，分别为犬瘟热病毒和犬冠状病毒特异性扩增条带，表示犬瘟热病毒和犬冠状病毒呈阳性；在这两处位置无可见扩增带，表示犬瘟热病毒和犬冠状病毒呈阴性。