[发明专利]一种引物组及其在鉴定马铃薯帚顶病毒中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种引物组及其在鉴定马铃薯帚顶病毒中的应用。

背景技术

马铃薯帚顶病毒（Potato mop-top virus，PMTV）为属于帚状病毒科(Virgaviridae)马铃薯帚顶病毒属(Pomovirus)的RNA病毒，是我国进境检疫性有害生物，主要分布在爱尔兰、丹麦、芬兰、挪威、荷兰、英国、捷克、日本、美国和加拿大等国家。马铃薯帚顶病毒严重影响马铃薯的产量和品质，受侵染的马铃薯块茎产生环状或弧状坏死，由病薯长成的马铃薯植株会表现出帚顶、奥古巴花叶和褪绿V型纹等症状。

马铃薯帚顶病毒可随病薯块或组培苗通过运输远距离传播，在田间可以通过土壤中的马铃薯粉痂菌Spongospora subterranea、汁液摩擦接种等途径传播。该病毒的传播介体-马铃薯粉痂菌在我国内蒙古、广东、贵州、江西、浙江、云南、甘肃等地均有报道。由于PMTV可以在马铃薯粉痂菌的休眠孢子中保持很长时间的侵染力，同时缺少有效的抗PMTV马铃薯品种，PMTV很难被控制。近年来，我国多次从马铃薯起源中心地区（如秘鲁、智利等）引进马铃薯品种资源，也从荷兰、英国、美国等马铃薯产业强国引进种薯、组培苗，加大了PMTV的传播风险，若其一旦传入国内，将会给我国马铃薯产业造成巨大损失，必须引起重视。

发明内容

本发明的目的是提供一种引物组及其在鉴定马铃薯帚顶病毒中的应用。

本发明首先提供了引物组A，包括DNA片段-Ⅰ、DNA片段-Ⅱ、DNA片段-Ⅲ和DNA片段-Ⅳ；所述DNA片段-Ⅰ、所述DNA片段-Ⅱ、所述DNA片段-Ⅲ和所述DNA片段-Ⅳ均为单链DNA片段；所述DNA片段-Ⅰ如序列表的序列1所示，所述DNA片段-Ⅱ如序列表的序列2所示，所述DNA片段-Ⅲ如序列表的序列3所示，所述DNA片段-Ⅳ如序列表的序列4所示。

所述引物组A可由所述DNA片段-Ⅰ、所述DNA片段-Ⅱ、所述DNA片段-Ⅲ和所述DNA片段-Ⅳ组成。

所述引物组A还可包括DNA片段-Ⅴ；所述DNA片段-Ⅴ为单链DNA片段，如序列表的序列5所示。

所述引物组A可由所述DNA片段-Ⅰ、所述DNA片段-Ⅱ、所述DNA片段-Ⅲ、所述DNA片段-Ⅳ和所述DNA片段-Ⅴ组成。

本发明还提供了引物组B，包括DNA片段-Ⅵ、DNA片段-Ⅶ、DNA片段-Ⅷ和DNA片段-Ⅸ；所述DNA片段-Ⅵ、DNA片段-Ⅶ、所述DNA片段-Ⅷ和所述DNA片段-Ⅸ均为单链DNA片段；所述DNA片段-Ⅵ如序列表的序列1的反向互补序列所示，所述DNA片段-Ⅶ如序列表的序列2的反向互补序列所示，所述DNA片段-Ⅷ如序列表的序列3的反向互补序列所示，所述DNA片段-Ⅸ如序列表的序列4的反向互补序列所示。

所述引物组B还可包括DNA片段-Ⅹ；所述DNA片段-Ⅹ为单链DNA片段,如序列表的序列5的反向互补序列所示。

所述引物组B可由所述DNA片段-Ⅵ、所述DNA片段-Ⅶ、所述DNA片段-Ⅷ、所述DNA片段-Ⅸ和所述DNA片段-Ⅹ组成。

本发明还保护以上任一所述引物组A或以上任一所述引物组B在辅助鉴定马铃薯帚顶病毒中的应用。

本发明还保护一种辅助鉴定马铃薯帚顶病毒的方法，依次包括如下步骤：

（1）以待测病毒的RNA为模板，用所述引物组A或所述引物组B进行RT-LAMP反应；

（2）通过检测步骤（1）的产物辅助鉴定待测病毒是否为马铃薯帚顶病毒。

可采用实时浊度仪进行所述步骤（2）的检测，如果出现扩增曲线、待测病毒为候选的马铃薯帚顶病毒，如果没有出现扩增曲线、待测病毒为候选的非马铃薯帚顶病毒。

可通过目测进行所述步骤（2）的检测，如果出现白色混浊物、待测病毒为候选的马铃薯帚顶病毒，如果没有出现白色混浊物、待测病毒为候选的非马铃薯帚顶病毒。本方法无需采用特定仪器，对于条件较艰苦的地域和单位更为实用。

RT-LAMP反应体系中含有钙黄绿素荧光染料时，可通过自然光或紫外灯下观察进行所述步骤（2）的检测。自然光下，如果体系显示为绿色、待测病毒为候选的马铃薯帚顶病毒，如果体系显示为橙黄色、待测病毒为候选的非马铃薯帚顶病毒。紫外光下，如果体系显示荧光、待测病毒为候选的马铃薯帚顶病毒，如果体系不显示荧光、待测病毒为候选的非马铃薯帚顶病毒。本方法无需采用特定仪器，对于条件较艰苦的地域和单位更为实用。