[发明专利]一种代谢工程改造大肠杆菌产圣草酚的方法

权利要求书

1.一种以酪氨酸为底物合成圣草酚的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌内构建了由酪氨酸合成柚皮素的途径，并融合表达了截去膜结合序列的黄酮3’羟化酶基因tF3’H和P450还原酶基因tCPR以实现由柚皮素向圣草酚转化的途径。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，敲除了大肠杆菌基因组乙酸激酶ackA基因，过表达了乙酰辅酶A合成酶基因和乙酰辅酶A羧化酶基因以强化丙二酰辅酶A途径。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，乙酰辅酶A合成酶基因acs来自E.coli BL21(DE3)基因组，乙酰辅酶A羧化酶基因acc来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)。

4.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，通过表达来自粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶基因tal，来自欧芹(Petroselinum crispum)的4-香豆酸：辅酶A连接酶基因4cl，来自矮牵牛(Petunia X hybrid)的査尔酮合成酶基因CHS以及来自紫苜蓿(Medicago sativa)的查尔酮异构酶基因chi，实现酪氨酸合成柚皮素的途径。

5.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述tF3’H和tCPR的融合基因tF3’H-tCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，是截去膜结合序列的源于非洲菊(Gerbera hybrid)的黄酮3’羟化酶基因tF3’H和长春花(Catharanthus roseus)的P450还原酶基因tCPR的融合基因。

6.根据权利要求5所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述tF3’H-tCPR基因通过克隆于pACYCDuet-1，得到重组质粒pACYC-tF3’H-tCPR，然后转化大肠杆菌进行表达。

7.根据权利要求4所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，编码所述TAL、4CL的基因通过克隆到载体pCDFDuet-1，得到pCDF-TAL-4CL，编码所述CHS和CHI的基因通过克隆到载体pETDuet-1，得到pET-CHS-CHI。

8.根据权利要求3所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A羧化酶基因acc包括accBC和dtsR1两个基因，所述基因acs、accBC和dtsR1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，它们通过克隆到载体pRSFDuet-1，得到重组表达载体pRSF-acs-ACC，然后转化大肠杆菌进行表达。

9.一种构建权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于，主要步骤如下：

（1）合成融合基因tF3’H-tCPR，连接载体pACYCDuet-1，得到重组表达载体pACYC-tF3’H-tCPR；

（2）敲除E.coli的乙酸激酶ackA基因，强化丙二酰辅酶A途径；

（3）将编码乙酰辅酶A合成酶的基因和乙酰辅酶A羧化酶的基因克隆到载体pRSFDuet-1，构建重组表达载体pRSF-acs-ACC；

（4）将编码酪氨酸解氨酶的基因tal、4-香豆酸：辅酶A连接酶的基因4cl克隆到pCDFDuet-1构建重组表达载体pCDF-TAL-4CL，将编码査尔酮合成酶的基因chs以及查尔酮异构酶基因chi克隆到载体pET Duet-1构建重组表达载体pET-CHS-CHI；

（5）将重组表达载体pACYC-tF3’H-tCPR、pRSF-acs-ACC、pCDF-TAL-4CL和pET-CHS-CHI一起转化敲除了乙酸激酶ackA基因的E.coliBL21(DE3)。

10.一种应用权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌生产圣草酚的方法，其特征在于，是将工程菌株在25mL LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以2%接种量转接到25mL发酵MOPS培养基中37℃培养，待菌种生长至OD₆₀₀=1.2-1.8时，添加新鲜的25mL发酵MOPS培养基和终浓度为0.6mM的IPTG诱导以及1mM的L-酪氨酸为底物，转至25℃低温诱导培养48h。