[发明专利]人脂肪间充质干细胞的制备方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人脂肪间充质干细胞的制备方法。

 

背景技术

脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪间充质干细胞（Adipose Derived Msenchymal Stem Cell, AD-MSC)，其生物学性质与骨髓间充质干细胞相类似，可向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化。

脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景，因此脂肪干细胞已成为干细胞领域一个备受关注的热点，具有广阔的临床应用前景。2012年1月，韩国FDA批准的自体脂肪干细胞药物Cuepistem成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘。同年10月，美国FDA批准了Cytori Therapeutics公司脂肪干细胞对心脏衰竭患者有效性的临床试验。

目前，传统的脂肪间充质干细胞制备包括脂肪的采集、运输、SVF(Stromal Vascular Fraction, SVF)提取、原代培养、传代培养、间充质干细胞冻存和复苏。获得的间充质干细胞在复苏后短时间内即应用于临床。传统制备方法存在以下缺点：1、前期细胞培养和冻存复苏过程耗费大量人力物力；2、细胞复苏后，从复苏到完全恢复活性需要较长时间，在较短时间内应用临床效果令人担忧；3、复苏后冻存液微量残留，在短时间内不能排除，会造成患者恶心、呕吐、发热等不良反应。

 

发明内容

为了克服现有技术领域存在的上述问题，本发明的目的在于，提供一种人脂肪间充质干细胞的制备方法。

本发明提供的人脂肪间充质干细胞的制备方法，它包括以下具体步骤：

（1）、脂肪的采集：无人源特定病毒的供体筛选合格后，无菌采集脂肪，可采用抽脂方式或者手术方式获取脂肪，采集量 10ml以上，采集后，将脂肪置于保存液中，2-8℃恒温保存；

（2）、脂肪的运输：将脂肪置于保存液中，2-8℃恒温保存在疫苗箱中，48h内送至实验室；

（3）、脂肪的交接：实验室接收脂肪，登记好客户信息，并进行客户编码；

（4）、制备脂肪微块：用含青霉素和链霉素的PBS反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪绞碎为0.5-1mm³的脂肪微块；

（5）、脂肪微块的冻存：二甲基亚砜和血清替代品按照1:9的比例混合配成冻存液，将脂肪微块用冻存液重悬，分装到冻存管中，放入冻存盒，置于-80℃冰箱过夜后，次日转移到液氮保存；

（6）、脂肪微块的复苏：从液氮中取出要复苏的脂肪组织微块，立即投入37℃无菌水浴锅中，匀速轻轻摇晃，使其在2分钟之内融化；

（7）SVF提取：0.1%胶原酶I消化脂肪微块，离心弃去上层，100um滤网过滤，获得SVF；

（8）、原代培养：按照1×10⁵个／ml接种到培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱，培养条件： 37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2% ，培养：人间充质干细胞无血清培养基；

（9）、传代培养：原代培养经7d左右，细胞融合达70%～80%时，按照5000～6000个/cm²的密度传P1，经3d，P1代融合达80%～90%时，同上，传P2，以此类推。

本发明提供的人脂肪间充质干细胞的制备方法，其有益效果在于，工艺简便，成本低，冻存效果好，细胞损伤小，最大程度降低了冻存液在细胞内残留，副作用小，对人体无害，制备出的人脂肪间充质干细胞可以用于临床治疗多种疾病。

 

附图说明

图1是本发明的冻存脂肪微块源人脂肪间充质干细胞生长曲线；

图2是本发明的冻存脂肪微块源人脂肪间充质干细胞（P0代-第3天-40倍）；

图3是本发明的冻存脂肪微块源人脂肪间充质干细胞（P0代-第7天-40倍）；

图4是本发明的冻存脂肪微块源人脂肪间充质干细胞（P3代-第3天-100倍）；

图5是本发明冻存脂肪微块源人脂肪间充质干细胞成脂肪诱导2周后油红O染色阳性结果图；

图6是本发明冻存脂肪微块源人脂肪间充质干细胞成骨诱导2周后碱性磷酸酶染色呈强阳性反应结果图。

具体实施方式

下面参照附图，结合实施例，对本发明提供的人脂肪间充质干细胞的制备方法，进行详细的说明。

实施例一