[发明专利]筛选钙激活氯离子通道抑制剂的细胞模型及筛选方法

权利要求书

1.一种筛选钙激活氯离子通道抑制剂细胞模型，其特征在于是一种共表达Anoctamin1或Anocatmin2和YFP-H148Q/I152L两种蛋白的FRT细胞，Anoctamin1或Anocatmin2和YFP-H148Q/I152L两种蛋白分别位于两个不同的真核表达载体，两种真核表达载体的真核抗性不同。

2.根据权利要求2所述的筛选钙激活氯离子通道抑制剂细胞模型，其特征在于所述Anoctamin1或Anocatmin2真核表达载体的抗性为Blasticidin，而YFP-H148Q/I152L真核表达载体的抗性为Hygromycin。

3.根据权利要求1所述的筛选钙激活氯离子通道抑制剂细胞模型，其特征在于所述的真核表达载体选自pUB6/V5、pcDNA3.1、pEGFP、pBudCE4.1、pCMV、pcDNA6或pcDNA4。

4.一种钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法，其特征在于依次包括如下步骤：

（1）构建Anoctamin1或Anocatmin2以及YFP-H148Q/I152L的真核表达载体；

（2）将上述两种载体分别稳定转染入适合高通量筛选的FRT细胞中，使FRT细胞共表达YFP-H148Q/I152L和Anoctamin1或Anocatmin2两种蛋白；并且经过多次有限稀释，获取高纯度和高表达效率的FRT细胞模型；

（3）将共表达YFP-H148Q/I152L和Anoctamin1或Anocatmin2的FRT细胞模型传代到黑壁透明底的黑壁微孔板中，细胞密度为每孔15000-25000个细胞，30-36h后细胞汇合度达到90%以上；

（4）首先将待测小分子化合物加入黑壁微孔板中，孵育10-15min，后加入使细胞内钙离子浓度升高的试剂和高浓度碘离子；如果加入的小分子化合物不是Anoctamin1或Anocatmin2抑制剂，YFP-H148Q/I152L荧光蛋白遇碘离子迅速淬灭；如果加入的小分子化合物是抑制剂，YFP-H148Q/I152L荧光蛋白不会淬灭。

5.根据权利要求4所述钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法，其特征在于步骤（3）中有限稀释的次数为3次。

6.根据权利要求4所述钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法，其特征在于步骤（3）中所述黑壁微孔板为96孔板。

7.根据权利要求4所述钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法，其特征在于步骤（4）中所述使细胞内钙离子浓度升高的试剂选自ATP、carbachol、ionomycin或者calcimycin，其组合方式为ATP、carbachol中的一种或两种，与ionomycin、calcimycin中的一种或两种同时加入。

8.根据权利要求7所述钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法，其特征在于步骤（4）中所述使细胞内钙离子浓度升高的试剂为ATP、carbachol、ionomycin和calcimycin同时加入。

9.根据权利要求4所述钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法，其特征在于还可以包括步骤（5）：重复步骤（4），但首先加入使细胞内钙离子浓度升高的试剂，ATP、carbachol、ionomycin和calcimycin同时加入；再加入小分子化合物孵育10-15min，后加入高浓度碘离子，检测相对荧光强度的变化，进一步验证小分子化合物是抑制剂。

10.根据权利要求9所述钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法，其特征在于还可以包括步骤（6）：用膜片钳试验验证测试结果。