[发明专利]一种基于质粒库的无引物基因合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因合成方法，是一种基于质粒库的无引物基因合成方法，属于基因工程技术领域。 

背景技术

近年来合成生物学的研究进展非常快，特别是基因合成技术。全基因合成是依照某一蛋白质的基因序列，设计合成相互重叠的单链寡核苷酸，再通过重叠延伸PCR法拼接出全长，基因合成无需模板，是获取基因的手段之一。通过全基因合成实现基因的分子改造和人工组建正成为一种实验室常规手段。因此，建立一种能够在相对低廉和短时间内准确和高效地设计和合成长片段基因的方法十分重要。 

随着合成生物学的研究越来越流行，特别是基因合成方法技术的研究。到目前为止，基因合成的方法都必须依赖于化学合成的寡核苷酸引物，据研究报道全基因合成的方法主要有以下三种：一是DNA的化学合成方法，即利用DNA合成仪器直接合成单链的DNA片段，化学法在保证合成质量的前提下，合成的DNA片段长度一股不超过90bp，所以化学合成方法主要用于合成寡核苷酸。二是PCR介导的合成方法，如重叠延伸PCR、TBIO法、PTDS法。PCR介导的方法由于需要PCR，这样就会导致对引物引进的错误进行积累和放大化，所以相对来说碱基的错误率比较高，据目前报道的PCR介导的合成方法错误率比较高，尤其对于合成大于2kb以上的DNA由于错误率高，所以为了得到正确的克隆，需要做多次克隆和测序的重复工作，这样成本会很高，周期也会加长；而且PCR介导的需要DNA高温聚合酶，dNTP等试剂，成本相对较高。三是非PCR介导的DNA合成方法，即直接通过体外或者体内的酶切酶连等操作将化学合成的DNA片段组装起来，如DNA的固相合成技术。非PCR介导的合成方法，目前报道的主要是一种DNA的固相合成技术，如Sloning技术，这种技术虽然错误率是很低，但是由于在合成的时候引物需要经过特殊的修饰，引物合成的成本比较高，而且权衡成本的考虑，每次只能增加3个碱基，这样合成大基因周期会比较长，所以不太实用。 

基因合成技术将会在越来越多的领域得到应用，并且发挥巨大的作用，但是合成基因中碱基的高错误率与昂贵的成本限制了全基因合成方法的应用，有必要导找新的基因合成方法来解决现有技术存在的问题，使基因合成技术得到更广泛的应用。 

发明内容

本发明提出了一种无引物的基因合成方法平台技术，这种基因合成方法打破了一直以来依赖于引物的基因合成技术。该方法主要通过构建一个包含有16384(4⁷，7bp的四个碱基的任意组合序列)个质粒的库，再用该库合成一系列相关的基因，主要是利用抗性基因重构的遗传筛选机制，从已构建好的含有7个bp的质粒出发，通过酶切酶连操作依次进行重构，通过四种抗性基因的重构，得到若干82bp的质粒，然后再把这些82bp组装合成长片段基因。主要步骤包括：载体的改造；16384(4⁷)个质粒的库的构建；82bp DNA片段的合成；多个82bp左右的DNA片段的组装合成长片段基因。 

具体做法如下： 

1)、构建抗性基因重构载体pNew(构建过程见图1)。 

a)、构建线性载体骨架pNew 

以商品化的pet23a、pet28b、pDEST32和利用PCR、套叠PCR、无酶克隆等常规技术构建的载体RNALIC质粒，用常规方法构建pNew的载体，以ori-PF／ori-PR(序列见表1)、pet23a质粒为模板，通过PCR扩增得到线性载体骨架，在反向引物ori-PR中引进限制性内切酶BseRI的识别位点，命名为pNew(1.9kb)(序列列表对应为NO1)。 

b)、构建线性载体骨架5SGCK