[发明专利]维罗纳气单胞菌菌蜕、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，具体地，涉及一种维罗纳气单胞菌菌蜕、其制备方法以及其应用。

背景技术

细菌菌蜕（bacterial ghost，BG）是革兰氏阴性细菌被噬菌体PhiX174裂解基因E的产物裂解后形成的完整细菌空壳。噬菌体PhiX174的裂解基因E编码具有91个氨基酸的疏水蛋白，它能够在革兰氏阴性细菌的细胞膜上形成一个直径约为40-200nm的特异性的跨膜孔道，在渗透压的作用下使革兰氏阴性细菌的胞质内容物由孔道排出，从而形成不含核酸、核糖体及其他组分的细菌空壳。经电子显微镜观察，该特异性的跨膜孔道并不是在细胞膜上随机分布，而是仅限于细胞的中央和两端。而这种灭活过程不会引起细菌表面结构的任何物理化学变化，其内外膜结构也保存良好。

菌蜕的生产是通过对裂解基因E的严格表达调控实现的。PhiX174的裂解基因E受控于多个表达系统，如温敏的启动子及其调控基因λpL/pR-CI857系统，或某些化学诱导性启动子LacpO-LacI^q，或tol等表达系统，其中应用最多的是在λpL/pR-CI857转录控制下实现E基因的可控表达。

实验证实，除大肠杆菌外，很多革兰氏阴性细菌均能在裂解基因E的作用下产生菌蜕，如：鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），胸膜肺炎放线杆菌（Antinobacillus pleuropneumoniae），霍乱弧菌（Vibrio cholerae），溶血性巴氏杆菌（Pasteuralla haemolytica），多杀性巴氏杆菌（Pasteuellamultocida），幽门螺杆菌（Helicobacter pylori），肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumonia）等。

由于制备菌蜕的过程中无需像制备灭活疫苗那样添加甲醛等化学物质，也无需高温物理灭活，因此细胞壁在很大程度上被完整地保存下来。细菌菌蜕可以作为一种很好的疫苗，因为其保留了活菌状态下的包膜结构和相关的抗原蛋白，如脂多糖、肽聚糖和菌毛等，从而能有效地被抗原呈递细胞（APCs）吞噬、加工和呈递。目前已知菌蜕可通过腹腔注射、肌肉注射、鼻饲、皮下、口服等途径免疫小鼠、兔子和猪等动物，并取得了良好的免疫效果。KatingerA等人用胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）菌蜕制成气雾剂来免疫猪，可诱导产生特异性黏膜免疫应答，完全抵抗由该种病原菌引起的胸膜炎，并且安全性很好（Katinger A,et a1.Pigs aerogenously immunized with genetically inactivated(ghosts)or irradiated Actinobacillus pleuropneumoniae are protected against a homologousaerosol challenge despite differing in pulmonary recombicellular and antibody responses.[J].Journal of Biotechnology,1999,73(2-3)：251-260）。Hensel等人还将福尔马林灭活的APP和APP BG经肌肉注射免疫猪，两组均能对相关的临床疾病起到完全防护作用，然而，只有菌蜕组对携带者有防护作用，可以防止疾病在猪群中的传播。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）菌蜕疫苗口服免疫小鼠后，在没有使用佐剂的情况下，其中一组的10只小鼠均得到了保护，另外一组10只小鼠中的5只得到了保护；当菌蜕和霍乱毒素共同使用免疫时，保护率达到了100%。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）菌蜕经口服免疫银鲫，菌蜕组和甲醛灭活组均产生了保护作用，保护率分别为78.95%和57.9%，显示菌蜕疫苗比普通灭活疫苗能更有效地激活鱼体的免疫保护反应（Hensel A,Huter V,Katinger A,et a1.Intramuscular imnunization with genetically inactivated(ghosts)Actinobacillus pleuropneumoniae serotype9protects pigs against homologousaerosol challenge and prevents carrier state.[J].Vaccine,2000,18(26):2945-2955）。