[发明专利]基因工程IFNα-2b融合蛋白质新型制备工艺

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及基因工程干扰素（IFN）α-2b融合蛋白质的新型制备工艺，更具体地说，本发明涉及基因工程IFN α-2b融合蛋白质的基因重新构建、可溶性形式表达和新型纯化制备工艺。

背景技术

干扰素是一种重要的细胞功能调节因子。干扰素具有广谱的抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节等生物活性，是一种重要的抗病毒、抗肿瘤治疗药物。

干扰素的种类繁多，有人体干扰素、动物干扰素、昆虫干扰素、植物干扰素和细胞干扰素。人干扰素主要来自人体白细胞和类淋巴细胞株，分α、β、γ、ω四个型别，其中人α干扰素有15种亚型 (α1 、α2a 、α2b ?) 。人的β型干扰素(HuIFN2β)和γ 型干扰素( HuIFN2γ) 公认的只有一个亚型。白细胞干扰素的制剂化面临有两个问题：首先大量生产必须保证有足够数量的外周血白细胞，其次以数百上千人血液中采集的白细胞用仙台病毒诱生时，必须保证不混入来自人体的病毒和基因。虽然采用目前的精制技术和处理方法提纯是可靠的，但由于这种干扰素难以制备，产量有限，价格昂贵，限制了其临床应用。利用基因工程技术批量生产干扰素使之临床应用成为现实。

20世纪80年代中期：第二代基因工程IFN α-2b问世，其分子结构、功能与人IFN几乎一致，于1986年被FDA批准用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎 (1991 年2 月)，继而被批准用于毛细胞白血病(1986 年6 月)、生殖器疣(1988 年6 月)、 AIDS 相关的Kaposi′s 肉瘤 (1988 年11 月)及多种肿瘤治疗如膀胱癌, CML , 头颈部肿瘤、恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤、非Hodgkin′s 淋巴瘤,肾细胞癌等。

目前，国内生产重组人干扰素的企业有 30 多家：其中半数以上企业生产IFN α-2b品种。其剂型主要包括注射剂、栓剂、滴眼液、乳膏等共有290多个文号。

在国内重组人干扰素市场，呈现国产药品和进口药品并存的格局。进口重组人干扰素主要有先灵葆雅、罗氏制药生产的PEG修饰的长效干扰素，价格偏高，平均单价在 1,300 元左右。国产重组人干扰素主要为普通干扰素，注射用干扰素α-2b单价（300万单位）在 30 元/支左右，普通干扰素市场竞争主要集中在国内生产企业之间。国内主要生物制药企业正在积极研制长效重组人干扰素，一旦研制成功正式投产，凭借区位及价格优势，国产重组人干扰素生产企业的市场份额将显著扩大。

近年来，我国重组人干扰素的销售额保持逐年平稳的增长，预计在未来三到五年内，重组人干扰素国内市场年增长率将保持在 10%-15%之间，预计到 2015 年我国重组人干扰素市场规模将达到 48 亿元左右。

然而，与市场需求不相适应的是国内几乎所有生产企业一直沿用旧的生产工艺，如大肠杆菌表达、包涵体分离纯化、尿素变性、再复性、纯化，尤其变性过程中使用高纯度尿素和复性过程中使用氧化-还原型谷胱甘肽为主要原料的复性剂，致使生产成本显著提高，复性率较低，同时产品中残存无活性的二硫键错配异构体，尽管纯度检测能够通过国家规定的95%，但无活性的二硫键错配异构体成分约占终产品的10-15%，故国内产品活性低、疗效差、副作用大，且通过传统工艺根本无法解决。近年来有人尝试利用高压液相反相色谱进行错配异构体的去除实验，通过C18层析柱+进口乙腈+进口三氟乙酸可以达到95%纯度，但工艺成本显著提高，其成本是原产品的三倍以上，尽管国家科技部新药创制重大专项将干扰素长效技术改造和提取工艺改造列为重点资助方向，但成效至今尚未显现。

发明内容

本发明目的无法去除错配异构体的现状及制造成本高的问题，而提供基因工程IFN α-2b融合蛋白质新型制备工艺。

基因工程IFN α-2b融合蛋白质基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示。

用于制备基因工程IFN α-2b融合蛋白质的基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

用于制备基因工程IFN α-2b融合蛋白质的基因，其碱基序列如序列表SEQ ID No.2所示。

一种表达载体，它是携带T7强启动子且含有多克隆位点的表达载体，并将其碱基序列如序列表SEQ ID No.3所示的基因，克隆到该表达载体的T7启动子之后；

所述的多克隆位点的表达载体为PET11a。

基因工程IFN α-2b融合蛋白质新型制备工艺，步骤如下：

1）人工合成碱基序列如序列表SEQ ID No.1和2所示的基因；