[发明专利]一种猪流行性腹泻活疫苗

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪流行性腹泻活疫苗及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，本病对不同年龄的猪均易感，尤其哺乳仔猪危害最严重，是一种高度接触性传染病。该病于1971年首发于英国，20世纪80年代初我国陆续发生本病。近几年，全国猪流行性腹泻呈爆发流行，给养殖业造成了巨大的经济损失。该病感染目前还没有有效的治疗方法，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，国外主要是韩国的弱毒苗，国内主要是哈兽研研制的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻灭活疫苗等，但临床应用效果不是很理想。因此，有必要筛选出低毒，且保持高免疫原性的猪流行性腹泻病毒来制备疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻活疫苗，即由一种弱毒性作为抗原制备的疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明的猪流行性腹泻疫苗，包含有抗原和保护剂，其中抗原是保藏编号为CGMCC No.8503的猪流行性腹泻病毒SD10株。

其中的保护剂可以为目前使用的任一种病毒疫苗用保护剂，

优选保护剂为蔗糖和明胶，其在疫苗中的质量百分比终浓度分别为5%和1%；

更优选在保护剂中添加酪蛋白酸钠，添加的质量百分比浓度为0.5%。

优选在保护剂中添加用于防止细菌感染的抗生素。

本发明的疫苗所使用的抗原猪流行性腹泻病毒SD10株的毒性低，免疫原性好，制成的疫苗免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻击，提高仔猪的存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的疫苗进行详细的描述。

实施例1：猪流行性腹泻病毒SD10株的筛选

1.1猪流行性腹泻病毒SD10株的分离和鉴定在进行流行病学调查时，从山东莱西某猪场送检的腹泻猪小肠内容物中分离到一株猪流行性腹泻病毒（命名为SD10A1株），猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测阳性，盲传至第8代出现细胞病变，第16代出现规律、稳定的细胞病变，病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml，能够被抗猪流行性腹泻病毒特异性血清中和，传至第121代时，传代的病毒对3～5日龄健康未吃初乳仔猪安全，纯净，无细菌、霉菌、支原体和外源病毒（猪瘟、猪细小病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合症、猪口蹄疫病毒）污染。将最终传代分离的SD10株（猪流行性腹泻病毒Porcine Epidemic Diarrhea Virus）进行保藏，于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8503。

1.2本毒株接种母猪后，母猪未见流产、早产等不良反应，所产仔猪未有腹泻发生。

1.3本发明毒株的病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml。

1.4本发明毒株安全性好，对3～5日龄健康未吃初乳仔猪安全。

1.5本发明毒株病毒液与冻干保护剂混合，经冷冻真空干燥制备的疫苗，免疫母猪后，所产仔猪能够100%抵抗强毒的攻击。

1.6克隆SD10株的ORF3基因,其全长为675bp,编码有224个氨基酸。通过在NCBI中进行blastn分析，结果分离的ORF3基因与已报道的猪流行性腹泻病毒的ORF3基因都存在3-5个氨基酸的差别。表明本发明所分离的SD10株与已有的猪流行性腹泻病毒都存在遗传上的差异，为一新的病毒株。

二、用筛选的SD10株制备疫苗

1.1疫苗的制备

1.2按照常规方法制备Vero细胞(Vero细胞购自美国ATCC)，生长液为含8%新生牛血清的MEM，培养细胞长成单层时接种SD10株病毒；

1.3取SD10株毒种（≥10^5.0TCID₅₀/0.1ml）按1%接种长势良好的Vero细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2%新生牛血清MEM维持液继续培养；

1.4接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况，细胞病变达75%以上时收获，反复冻融3次；