[发明专利]重组犬流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组病毒株，尤其涉及一种犬流感重组病毒、其制备方法及由其制备得到的疫苗。本发明属于生物工程技术领域。

背景技术

犬流感（Canine influenza，CI）是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒中的犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）引起的犬的一种呼吸道急性高度接触性传染病，多呈暴发性流行，传播非常迅速而且广泛。

目前流行的犬流感主要是由H3N8亚型和H3N2亚型犬流感病毒引起的。H3N8亚型犬流感是由马流感病毒跨种传播而导致，主要在国外流行，我国尚没有马流感病毒感染犬的报道。自2006年以来，在我国江苏、广东、北京、浙江和辽宁等地相继发生了禽源H3N2亚型流感病毒感染犬并导致犬发生严重呼吸道疾病的事件，血清学调查发现犬群中禽源H3N2犬流感的阳性率达到10%以上，表明H3N2CIV在犬群中已经占据了一定的生态地位，具有普遍流行的特征。禽源H3N2CIV不仅可以感染犬，而且可以感染雪貂和猫，表明该病毒已经跨越种间障碍，具备了感染哺乳动物的能力。而犬是一种伴侣动物，与人之间的接触非常密切，这也增加了人感染H3N2CIV的风险。

疫苗是防控病毒性传染病的有效手段，而H3N2CI是犬的新发传染病，目前国内外尚没有预防该病的疫苗。因此研发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效CI疫苗具有重要的公共卫生学意义。

发明内容

本发明目的之一是提供一株重组犬流感病毒（CIV），其包含H3N2亚型CIV的HA和NA基因、以及H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的6个内部基因。

本发明目的之二是提供一种上述重组犬流感病毒的制备方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一株重组犬流感病毒（CIV），是通过以下方法制备得到的：

（1）将H3N2亚型犬流感病毒的HA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含犬流感病毒HA基因的重组质粒；

（2）将H3N2亚型犬流感病毒的NA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含犬流感病毒NA基因的重组质粒；

（3）将H9N2亚型禽流感病毒的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NS和M分别插入到流感基因转录/表达双向载体中，分别获得含有各基因的重组质粒；

（4）将以上获得的8个重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞共培养细胞单层，转染后的细胞经培养后，反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子，将含有细胞裂解物的培养液离心后，取上清液接种SPF鸡胚，培养2-3天后，取鸡胚尿囊液，检测其血凝活性，获得重组犬流感病毒。

在本发明中，优选的，所述的流感基因转录/表达双向载体为pHW2000。

在本发明中，优选的，所述的H3N2亚型犬流感病毒的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。

在本发明中，优选的，所述的H3N2亚型犬流感病毒的NA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。

在本发明中，优选的，所述的H9N2亚型禽流感病毒的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、NS和M的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3-8所示，或与SEQ ID NO.3-8所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施例中，将得到的一株重组犬流感病毒命名为rH3N2-DL，分类命名为：H3N2犬流感病毒；保藏时间是：2013年9月6日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC No.8162。

本发明的目的之三在于提供该重组CIV在制备预防或治疗犬流感药物，特别是犬流感疫苗中的应用。

实验证明，本发明的重组CIV，在鸡胚和MDCK细胞上均能产生比亲本毒株高很多倍的病毒滴度和血凝滴度，可作为研制犬流感疫苗的优良种毒。

本发明的一种犬流感疫苗，其特征在于由下述方法制备：用以上任一项所述的重组CIV接种SPF鸡胚或MDCK细胞，收获鸡胚尿囊液或细胞培养上清，灭活，乳化，即得。