[发明专利]多组分同时定量分析的均相发光免疫分析方法及其所使用的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种多项组分同时测定的均相发光免疫分析方法，其特点是能够同时定量分析待测样本中多种生物标志物，可应用于临床检验诊断领域。

背景技术

标记免疫分析是一种超微量生物分析方法，它利用抗原-抗体间的高亲和性以及作为探针的标记物的高度可测性，能够对生物样本中超微量物质进行准确的定量分析，具有操作简单、特异性高、敏感度高等优势，已成为生物学、临床医学等领域研究的重要检测手段之一。

鲁米诺氧途径免疫分析（luminol oxygen channel immunoassay,LOCI）技术是一种新型标记免疫分析，与LOCI技术类似，上海博阳生物技术有限公司也开发一种称为光激发化学发光分析（light initiated chemiluminescent assay，LICA）技术。无论LOCI还是LICA，由于整个检测过程中不需分离游离标记物而直接检测光信号强度，故被称为均相发光免疫分析。由于LICA是发光分析和免疫分析相结合而成，故还是称之为光激发化学发光免疫分析系统更为恰当。整个检测系统由供体微球和受体微球组成，利用供体微球和受体微球及抗原-抗体间相互作用来定性或定量分析生物分子（如抗原或抗体）。供体微球和受体微球的粒径约150nm左右，微球表面覆盖了一层水凝胶，作为连接生物分子的功能基团。同时，供体微球含有光敏剂，受到光激发后可激活周围氧分子；而受体微球含有化学发光剂和荧光素物质，活性氧激发化学反应为荧光素的激发提供能量，激发后发射光学信号。当生物分子（抗原-抗体）间存在相互作用时，这种相互作用会将供体微球和受体微球拉近，从而激发级联放大的化学反应，产生极强的信号。具体来说，在激光（波长680nm）的照射下，供体微球上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微球，与微球表面的化学发光剂反应，进一步激活了同样在受体微球上的荧光素，使之发出一定波长的荧光。单体氧的半衰期为4微秒，在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子间不存在特异的相互作用，单体氧无法扩散至距离较远的受体微球，则不会有荧光信号产生。光激发化学发光免疫分析具有很高敏感度和特异度，整个检测过程中不需分离过剩的游离标记物（生物素化抗体分子和抗体包被受体微球），也就是说，该技术不同于现有的发光免疫分析（化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析、荧光免疫分析等），具有操作简单、分析时间短、精密度高等众多优点，深受临床实验室喜欢并广泛应用。

在临床医学检验诊断领域中，有些检测需要多项指标联合测定，如肿瘤高危人群做肿瘤标志物筛查时，需要同时检测血清甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖链抗原125（CA-125）、铁蛋白（Ferr）等；献血员筛查时需同时检测是否感染人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）；优生优育领域筛查唐氏综合症胎儿时需同时检测孕妇血清中妊娠相关蛋白A（PAPP-A），甲胎蛋白（AFP）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）等。以上检测所涉及的生物标志物于体内含量较低，目前一般采用标记免疫分析方法，特别是采用发光免疫分析（化学发光免疫分析和电化学发光分析）、时间分辨免疫分析等。当然，光激化学发光免疫分析也可应用于上述生物标志物的测定。但是，无论哪一种发光免疫分析（含光激化学发光），由于只使用一种探针（或标记物），如化学发光采用吖啶脂为探针，故在一次检测过程中，只能对单一标本中的单一一种生物标志物进行定量分析，不能够同时对单一标本中的多个生物标志物进行定量分析。现有检测模式不仅浪费时间、人力，增加检测成本，又需要较多血清样本。

生物芯片是一种能够对单一标本多个组分同时进行处理和分析的技术生物技术。根据芯片上固定的探针种类不同，分为蛋白芯片、核酸芯片、细胞芯片和组织芯片等。其中，蛋白芯片是指在固相载体上直接合成短肽探针，或者直接将大量的短肽探针以一定方式（如微阵列）固化于载体表面，然后与配体进行杂交，通过对信号进行检测分析得出反应结果。蛋白芯片中依靠抗原-抗体反应特异性结合的称为免疫芯片。免疫芯片可以分为微阵列芯片和液相流式芯片。微阵列芯片是用玻片、硅片或尼龙膜等作为载体，利用放射自显影或者激光共聚焦显微镜扫描进行检测，其缺点为不能准确定量。液相流式芯片是用高聚分子微粒为载体，用流式细胞仪检测标记抗体的荧光强度，其缺点是需要对微粒进行逐一检测，速度较慢。一般情况下，生物芯片倾向于数百种参数同时测定，而只需测定几个参数时不需要采用生物芯片技术。此外，生物芯片因技术复杂，检测成本较高，不适合临床常规标本的检测。

发明内容