[发明专利]生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株及其构建

说明书

 

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株及其构建。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机，实现人类可持续发展的关键。

纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡糖苷酶的共同作用。其中内切酶降解长片段的纤维素成为二聚体，是纤维素降解的关键步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、条件温和、转化率高的特点，但是纤维素酶较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。

降低纤维素酶成本一个有效的方法是提高酶的利用效率。由于纤维素的降解需要三种酶的协同作用，具有两种功能或多种功能的蛋白能显著地提高纤维素酶的利用效率，从而降低纤维素酶工业化利用的成本。同时纤维素酶的稳定性越好，纤维素酶能更长时间的降解纤维素，因此具有更大的应用价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株。

本发明的另一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的DNA片段。

本发明的再一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的质粒。

本发明的目的还在于提供上述酵母菌株的构建方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

用于构建生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的DNA片段，包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、具有纤维素内切酶和葡糖苷酶活性的序列、酿酒酵母TDH3终止子序列；上述序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。

优选的，所述的用于构建生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID NO.5所示。

用于构建生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的质粒为包含上述DNA片段的真核表达质粒。所述的真核表达质粒优选为pPIC9K质粒。

所述的用于构建生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的质粒优选通过包含如下步骤的方法制备得到：合成两端有限制性内切酶识别位点含有上述DNA片段的序列，通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。所述的真核表达质粒为pPIC9K质粒时，限制性内切酶优选为AatⅡ和NotⅠ。

一种生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株，含有上述质粒。所述的酵母菌株优选为酵母菌株SMD1168。

所述的生产具有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性蛋白的酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：制备酵母电转化感受态细胞，将上述质粒通过电转化转进酵母中得到。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

本发明构建了一个有纤维素内切酶和葡糖苷酶双活性的蛋白。同时，本发明把具有纤维素内切酶和葡糖苷酶活性的蛋白在酵母菌中实现了高效表达，纤维素内切酶和葡糖苷酶的活性达1.2 U/mL和0.3 U/mL，进一步降低了纤维素酶的工业化利用成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

A、大肠杆菌pPIC9K质粒提取

（1）接1%含pPIC9K质粒的大肠杆菌细胞于2 mL LB培养基。 

（2）37 ℃振荡培养12 h。

（3）取1.5 mL菌体于EP管，以4000 rpm离心3 min，弃上清液。 

（4）加0.l mL溶液I（1%葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0，25 mM Tris-HCl pH 8.0）充分混合。 

（5）加入0.2 mL溶液II（0.2 mM NaOH，1% SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min。 

（6）加入0.15 mL预冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，冰浴5 min。

（7）以10000 rpm离心20 min，取上清液于另一新EP管。

（8）加入等体积的异戊醇，混匀后静置10 min。 

（9）再以10000 rpm离心20 min，弃上清。 

（10）用70%乙醇0.5 mL洗涤一次，抽干所有液体。

（11）待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE缓冲液中。

B、pPIC9K-END质粒构建