[发明专利]一种甲基营养菌及其发酵生产吡咯喹啉醌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲基营养菌及其发酵生产吡咯喹啉醌的方法，属于生物技术领域。

背景技术

吡咯喹啉醌（Pyrroloquinolinequinone，PQQ），化学名称为4，5-二氢-4，5-二氧化-1-氢吡咯（2，3f）醌-2，7，9一三羧酸，别名Methaxatin，是1979年由Salisbury等人发现的，最初描述是在细菌细胞中作为膜结合脱氢酶的氧化还原辅因子。目前，在许多不同生物体内都发现存在PQQ，它可以防止活细胞被体内或体外的氧损伤；还可作为营养因子和维生素促进细胞生长和提高细菌在极端条件下的耐受性；哺乳动物细胞分化中诱导蛋白激酶的产生；通过增加不溶性磷酸盐的可利用性和作为生物防治剂来提高作物生产力；利用氧化还原特性应用于生物传感器；众多发现已经将PQQ具有异常高的氧化还原循环能力和它在抗神经细胞衰老、抗癌、药剂、作为信号分子等方面的潜力关联起来，其应用一旦成功，PQQ将发挥不可替代的重要作用。总之，吡咯喹啉醌有多种功能，作为营养因子或维生素参与多种生命活动（Journalofbiosciences,2012,37(2):313-325.），在农业、医药、轻工业和食品业等方面具有重要的开发价值。

目前，化学法生产PQQ步骤繁杂、产率低、副产物多、提取纯化步骤多，并用到有毒化学试剂，污染严重且后续处理困难（JournaloftheAmericanChemical Society,1981,103:5599-2600.）。微生物发酵法具有降低生产成本，清洁低碳、温和可控等优势；同时发酵法一般以甲醇为唯一碳源，培养基以无机盐为主，这有利于产品的提取。

迄今发现的能过量产生PQQ的野生菌包括：无色杆菌属（Achromobacter）、交替单胞菌属（Alteromonas）、弯杆菌属（Ancylobacter）、生丝微菌属（Hyphomicrobium）、甲烷单胞菌属（Methanomonas）、甲基菌属（Methylobacillus)、甲基单胞菌属（Methylomonas）、嗜甲基菌属（Methylophilus）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、微环菌属（Microcyclus）、枝动菌属（Mycoplana）、假单胞菌属（Pseudomonas）、精朊杆菌属（Protaminobacter）、原单胞菌属（Protomonas）、硫杆菌（Thiobacillus）、黄色杆菌属（Xanthobacter）（生物技术通讯,2009,20(6):874-879.），以及粘球菌属（Myxococcus）（生物技术通报,2013,1:029.）和副球菌属（Paracoccus）（海洋渔业,2012,34(1):89-95.）等。其中以甲基营养型细菌的PQQ生物合成水平最高。专利US4,994,382公布了副球菌IFO13301、精朊杆菌IFO3708和假单胞菌FERMP-7596发酵制备PQQ，产物浓度分别为4.5mg/L、5.8mg/L、30mg/L；US5,344,768公布了甲基杆菌、弯杆菌、生丝微菌等属的29株菌种，其PQQ生产水平也只为0.07mg/L-7mg/L；WO2012/118225A1公开了通过基因工程手段将M.extorquensstrainAM1和H.denitrificansstrain ATCC51888两株菌进行修饰，改造后最高产量分别才为114mg/L和10.9mg/L。中国专利CN102061278A公开了食甲基菌Methylovorussp.MP688(CGMCCNo.4096），在常规培养基和培养条件下，PQQ产量达到125mg/L；虽然CN103224965A公布了经优化后在7.5L罐上的PQQ产量可达2g/L，但是，多数野生菌的PQQ产量在2-3mg/L，筛选高产菌株仍是发酵制备PQQ工业化的关键。

本发明从江苏无锡锡南农药厂周围土壤分离筛选得到一株甲基营养菌YHT-1，属于PQQ产生菌新菌属，其产量明显高于一般野生菌株，通过优化培养基和培养条件进一步提高产物浓度，并且通过一步纯化发酵上清液就可得到纯度较高的PQQ产物。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种Methylopilasp.YHT-1菌株，是一株甲基营养菌。

所述Methylopilasp.YHT-1已于2014年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014016。