[发明专利]利用染料与胶体金之间荧光共振能量转移检测三聚氰胺

说明书

技术领域

利用染料与胶体金之间荧光共振能量转移检测三聚氰胺，属于分析化学技术领域。

背景技术

作为一种重要的氮杂环有机化工原料，三聚氰胺被广泛应用于塑料、建材、制药、造纸和纺织等行业。但是它是一种非法的食品添加剂，不能被用于食品行业中。三聚氰胺的结构如下：

三聚氰胺是一种白色无臭单斜棱晶体，在较高的温度下会生成有害的氰化物。它的水溶性较差，同时水溶液呈弱碱性。它在强酸或强碱性溶液中会发生水解，氨基逐步为羟基所取代，使其最终转化为三聚氰酸。

三聚氰胺的含氮量高达66%，不法分子正是因为这一特点而向食品中添加三聚氰胺，虚增食品中的蛋白质含量，而传统的凯式定氮等方法根本无法区分氮的来源。

三聚氰胺的急性口服毒性较低，然而，长期或反复地大量摄入三聚氰胺，患肾结石甚至急性肾衰竭和膀胱癌的几率会大大增加。这是因为三聚氰胺在体内会部分转化为三聚氰酸，而三聚氰胺与三聚氰酸会结合形成无法溶解的氰尿酸三聚氰胺，进而引起一系列生殖和泌尿系统疾病。

2007年，美国相继爆发多起宠物肾衰竭致死事件，原因为饲料中存在三聚氰胺。2008年9月，含三聚氰胺的婴幼儿奶粉造成上万的婴幼儿出现尿路结石，有死亡病例发生；随后在国内外多家奶粉、液态奶及其他奶制品中检测出三聚氰胺。这一系列事件使得全社会对食品安全问题的关注上升到了一个前所未有的高度。

目前，三聚氰胺的检测手段主要包括液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱法（LC-MS）等。尽管这些方法灵敏度高，这些方法需要昂贵的设备，测定时间较长，成本高，需要专业技术人员操作，不适合现场快速检测。因此需要建立一种快速、简单、灵敏的方法检测牛奶及乳制品中三聚氰胺的含量。

国标中采用高效液相色谱法检测原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的的定量限为2mg/kg。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用罗丹明B(RB)与金纳米粒子（AuNPs）之间的荧光共振能量转移快速检测三聚氰胺的方法，以快速、简单、灵敏的检测乳制品中三聚氰胺。

技术问题：利用罗丹明B与金纳米粒子之间的荧光共振能量转移快速检测三聚氰胺的方法基于以下原理：

在罗丹明B中加入金纳米粒子后，由于荧光共振能量转移作用，RB的荧光强度会降低。

加入三聚氰胺(Melamine)后，三聚氰胺会强烈的结合到AuNPs表面，从而释放结合的RB。

此外，三聚氰胺会迅速地引起AuNPs的团聚，从而减少了RB发射光谱与AuNPs吸收光谱的光谱重叠。因此，荧光共振能量转移减少的RB分子的荧光发射会显著恢复。

本发明的技术方案：

包括以下步骤：柠檬酸盐稳定的AuNPs的合成；利用荧光法观察含有不同浓度三聚氰胺的RB-AuNPs体系，运用RB的荧光恢复检测三聚氰胺。

（1）柠檬酸盐稳定的AuNPs的合成：

所有的玻璃器皿都用新制备的王水浸泡24小时，再用蒸馏水漂洗干净，80℃烘干备用。100ml1mM HAuCl4加热至沸腾，然后向其中迅速加入10ml38.8mM柠檬酸钠溶液并大力搅拌。溶液刚开始变为浅灰，然后变成酒红色。溶液加热回流并保持搅拌10分钟，然后移除加热装置并继续搅拌15分钟。最后溶液自然冷却至室温，并用0.4μm微孔膜过滤，4℃冷藏备用。

（2）利用荧光法观察含有不同浓度三聚氰胺的RB-AuNPs体系，运用RB的荧光恢复检测三聚氰胺。分析步骤如下：

首先，15μL25μM RB溶液与300μL11nM AuNPs混合。然后加入300μL of10mM柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸/柠檬酸钠）调节pH至5.5，反应7分钟。接着，向上述混合液中分别加入1ml不同浓度的三聚氰胺溶液，再用蒸馏水稀释至3ml，进一步反应18分钟。记录混合液在575nm处的荧光强度，存在三聚氰胺时F，不存在三聚氰胺时F₀，以(F-F₀)/F₀比三聚氰胺浓度绘制标准曲线。