[发明专利]禾谷缢管蚜EF1-α内参基因部分序列、克隆方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及禾谷缢管蚜参照基因EF1-α基因部分序列、克隆方法及其作为内参基因在RT-qPCR中的应用。

背景技术

禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi L.，RP）隶属于同翅目蚜科(Homoptera:Aphididae)。这种蚜虫在世界范围广泛分布，是禾本科植物重要的害虫之一。除了能通过吸食植株营养而直接影响谷物产量外，它主要是作为禾本科作物和杂草病毒病的传播介体造成危害。禾谷缢管蚜以持久性非增殖方式传播黄矮病毒，是黄症病毒科黄症病毒属多种大麦黄矮病毒的优势传毒介体。

在禾谷缢管蚜刺吸取食受黄矮病感染的植株韧皮部汁液的同时，它也取食到了存在于韧皮部病毒粒体。在介体蚜虫的中肠和/或后肠以及唾液腺中发生受体介导的胞吞胞吐。黄矮病在寄主植物体内的增殖一般地采用绝对和相对定量的方法，但是还没有关于在获毒期，接毒期以及影响传毒效率、传毒周期田间植物病毒流行的所有关键时期的介体体内病毒的滴度和积累变化的研究报道。病毒进入介体蚜虫体内后，伴随着无数的基因表达呈上调或下调，许多蛋白通过一种转胞吞的方式被整合成与病毒传播相关。应用反转录实时定量PCR(RT-qPCR)，我们能迅速地评价分子功能和生物学过程中病毒的影响以及病毒的实时浓度。

近年来，定量PCR（qPCR）中相对定量的方法较为流行，它消除了在实验处理间、RNA提取效率及RNA完整性方面等系统误差，应用到了分子研究工作的许多方面。在生物体中，看家基因（House-keeping gene）在所有细胞中都是保守的，在正常或非正常情况下都是持续表达的。可以通过目的基因与看家基因的比较来得出目的基因的表达水平和改变。因此，在RT-qPCR实验中，选择适合的、可信的看家基因作为内参基因是必不可少的。随着果蝇（Drosophila melanogaster）和小菜蛾（Plutella xylostella L.）等不同的昆虫全基因组序列的发表，寻找看家基因作为内参基因成为这些完全变态昆虫的研究重点之一。在运用RT-qPCR分析昆虫基因表达的实验中通常用下列内参基因，如18S rRNA,ACT1,EF1-α,GAPDH,UBI,RPSs,RPLs和TUB等。对于不完全变态昆虫，特别是传播多种植物病毒的蚜虫，近年来开展了大豆蚜（Aphis glycines）看家基因的研究。对于监测介体禾谷缢管蚜体内病毒基因的变化，用RT-qPCR确定病毒基因表达的相对水平，还没有找到有效适用的看家基因。尽管有研究中ACT1基因已被用来作为检测禾谷缢管蚜中两种植物病毒的内参基因，但这个基因实际上是来源于家蚕(Bombyx mori)的。作为蚜虫的核基因，EF1-α的部分基因序列已成为禾谷缢管蚜的群体遗传多样性的分类依据，但是作为看家基因用于研究其它基因的表达变化尚未见报道。

发明内容

本发明提供禾谷缢管蚜EF1-α基因片段，可作为禾谷缢管蚜内参基因的应用。

并同时提供克隆禾谷缢管蚜的EF1-α的特异性引物，建立基于SYBR GreenI染料技术的RT-qPCR方法，从而为禾谷缢管蚜的EF1-α作为内参基因，在利用qPCR对禾谷缢管蚜功能基因或作为传毒介体病毒在体内增殖变化的研究中提供有用的方法。

禾谷缢管蚜EF1-α基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种禾谷缢管蚜EF1-α基因的部分序列的克隆方法，提取禾谷缢管蚜基因组总RNA，采用引物EF1-αR进行RT-PCR扩增，以产物第一链cDNA作为模板、以引物对EF1-αF/EF1-αR进行PCR扩增，得到阳性克隆，最后经测序验证。其中引物序列为：

EF1-αF：5′-ATTGATATTGCTTTATGGAAATTCG-3′；

EF1-αR：5′-ACCAGGGTGGTTCAATACAATAAC-3′。

所获得的目的片段大小为837bp。

所述PCR扩增的反应条件如下：94℃3min，[94℃30s、56℃45s、72℃1min]，30个循环,72℃延长10min,4℃保存。

本发明还提供一种qPCR扩增EF1-α基因部分序列的方法，抽提禾谷缢管蚜基因组总RNA，以试剂盒中自带的引物混合物（包括Oigo dT Primer和Random6mers）为引物进行RT反应，然后以产物第一链cDNA作为模板进行定量PCR扩增，荧光染料为SYBR Green I，其中定量PCR扩增中的禾谷缢管蚜的定量引物，其序列为：