[发明专利]Orexin-A聚乙二醇化修饰物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及用聚乙二醇修饰orexin-A的修饰产物及其制备方法，属于医药化学领域。

背景技术

蛋白质和多肽类药物聚乙二醇(PEG)化技术是指利用聚乙二醇衍生物对蛋白和多肽类药物进行化学修饰的一项热门技术。随着现代基因工程手段的使用，人们能够大量获取所需的蛋白质，但由于天然或重组的未经任何修饰的蛋白质类药物易引起免疫反应，以及其在体内半衰期较短等原因而减弱了临床效果，也大大限制了它们的使用。相比之下，部分聚乙二醇修饰的蛋白质包括聚乙二醇与蛋白质和多肽类药物的物理结合物和化学修饰物，可改变蛋白质药物的一些性质，如：                                                增加此类药物的溶解度和稳定性。减少或消除免疫原性，抗原性和毒性。改善药物体内的药动学性质，增加药物在体内的半衰期。增加药物的治疗指数，扩大临床使用等。因此，近年来有越来越多的聚乙二醇修饰化蛋白药物上市或者进入临床。例如Enzon公司开发的治疗免疫缺陷性疾病的腺苷脱胺酶，治疗白血病、恶性黑色素瘤的PEG化天冬酰胺酶、PEG化干扰素α-2b，罗氏的PEG化干扰素α-2b等。

Orexin-A是存在于下丘脑的一种神经多肽，参与调节饮食，睡眠-觉醒周期、生殖、体温、血压、激素分泌和感觉等生理功能，研究发现orexin-A具有促觉醒和抗脑缺血损伤的作用。然而，orexin-A很不稳定，已报道的体内半衰期只有半小时左右，这大大限制了orexin-A的开发应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定性好，体内半衰期长和安全性好的orexin-A修饰物，以克服orexin-A的上述不足，其修饰后产物对原有蛋白活性影响较小，未改变原有蛋白的功能；

本发明另一目的在于提供上述修饰物的制备方法，其产物均一性好、分离纯化简单。

本发明实现过程如下：

为实现上述目的，本发明提供一种orexin-A的聚乙二醇化修饰物，所述修饰物是由orexin-A的N末端氨键以共价键与聚乙二醇分子相连接。具体来说，与orexin-A的N末端氨键相连接的聚乙二醇为烷基化或酰基化的单甲氧基聚乙二醇。烷基化或酰基化的聚乙二醇常用于蛋白质氨基的修饰，而单甲氧基聚乙二醇分子一端的羟基被甲氧基封闭，只有一端可以与orexin-A连接，不会产生多个orexin-A交联的形式，从而防止了多个orexin-A交联凝聚而变性。

上述聚乙二醇的分子量介于4000-30000Da，优选为5000、10000、15000或20000 Da；

烷基化或酰基化的单甲氧基聚乙二醇分子优选为单甲氧基聚乙二醇丙醛或单氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂。

本发明提供上述结构的orexin-A修饰物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将摩尔比为1:5-1:50的orexin-A与单甲氧基聚乙二醇丙醛或单氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂在pH为4-9、温度为4-37℃条件下反应0.5-24小时后，加入小分子氨基酸终止反应;

（2）将步骤（1）的反应产物经过SepHadex G-50色谱柱除盐，将除盐后收集的蛋白上样于QAE-SepHadex A-50阴离子交换柱,用10mM PB缓冲液洗脱，收集洗脱峰, 浓缩并冷冻干燥，即得orexin-A聚乙二醇化修饰物。

 上述反应条件优选为：摩尔比1:10-1:30，pH为6-8， 温度为20-25℃，反应时间为4-6小时。

本发明制备的orexin-A聚乙二醇化修饰物可用于制备治疗促觉醒和抗脑缺血损伤药物。

本发明制备得到的orexin-A聚乙二醇化修饰物保留原有蛋白活性，未改变原有蛋白的功能，产物均一性好，分离纯化简单。

具体实施方式

本发明实施例所用原材料除单氧聚乙二醇丙醛和单氧基聚乙二醇琥珀酰胺碳酸脂购自美国Shearwater公司外，其余均为常规试剂，以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

orexin-A聚乙二醇化修饰物的制备方法，包括下述步骤：

（1）称取10mg的orexin-A，溶于10ml的PB缓冲液（10mM，pH=6），然后按摩尔比为1:10的比例加入单氧聚乙二醇丙醛（分子量：5000Da）并混匀，放置于25℃条件下反应6小时后终止反应；