[发明专利]扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法及其应用

权利要求书

1.扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤： 

(1).DNA提取：采用CTAB法提取扁穗牛鞭草基因组DNA； 

(2).ISAP引物序列的PCR扩增：在Bio-Rad icycler PCR仪上进行PCR扩增，对72对引物进行多态性筛选； 

(3).ISAP-PCR产物的电泳检测：用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳仪上电泳，银染法后拍照，得照片； 

(4).数据统计及分析：在相同迁移位置，人工记录每个引物的扩增片段，有带记为1，无带记为0，形成原始“0，1”二元数据矩阵； 

(5).DNA指纹图谱的构建：根据照片上引物扩增情况，挑取具有代表性的ISAP多态性带，绘制扁穗牛鞭草的DNA指纹图谱。 

2.根据权利要求1所述的扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤1中DNA提取包括如下步骤： 

(1)取适量植物组织置于研钵中，加入约30mL的液氮，捣碎叶片，等液氮快挥发完时，快速研磨到粉状，把粉末转移到有标记的2.0ml无菌离心管中；加入800μL65℃预热的DNA提取液于2.0ml无菌离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20-60min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；取出样品管按体积比24∶1加入700μL氯仿／异戊醇颠倒充分混匀后，12000rpm离心5min，得上清液； 

(2)将步骤(1)所得的上清液吸取到一个新的1.5mL无菌离心管；缓慢加入预冷的异丙醇，加入量按吸取上清液体积的2／3计，上下摇动离心管，注意观察DNA将从溶液中析出，-20℃放置30min，使得DNA成团，12000rpm离心5min，将析出的白色絮状DNA沉淀转入新的1.5mL无菌离心管；加入75％的乙醇溶液900μL，清洗2-3次，混匀，4℃，12000rpm离心6min，倒掉上清液，然后用无水乙醇洗涤一次，室温下放置数分钟；加入500μL的TE缓冲液， 37℃保温1h以除去DNA中的RNA；在无菌离心管加入500μL苯酚、氯仿和异戊醇的混合物，氯仿和异戊醇的混合物各抽提一次，充分混匀，在室温下12000rpm，离心5min； 

(3)取上清液于另已1.5ml无菌离心管中，加入200μL5mol／L的NaCl和750μL饱和水乙醚，轻摇5min，在室温下12000rpm，离心10min；小心除去上层乙醚，将下层液体移到鑫的1.5ml无菌离心管中，加入1／10体积的NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃沉淀DNA1h；12000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇、无水乙醇各洗涤1次，室温放置5min； 

干燥后加入150-200μL双蒸水或0.1×TE缓冲液，放在4℃冰箱中保存； 

(4)采用紫外分光光度计法检测DNA的含量，检测260、280nm处的OD值，计算得出DNA的含量。如OD260／OD280=1.8左右，DNA较为纯净；<1.8，则有蛋白污染；>1.8，则有RNA污染。同时，还可进一步用1％的琼脂糖电泳检测DNA的质量，以得到非常直观的效果。 

3.根据权利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述DNA提取为2％CTAB；1.4mol／LNaCl；20mmol／L EDTAPH8.0；100mmol／LTris-HClPH8.0；2％β-巯基乙醇。 

4.根据权利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述TE缓冲液为10mmol／L Tris-HCl，1mmol／LEDTA，PH8.0)溶解，加入3μLRNAase(10mg／ml。 

5.根据权利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中苯酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1。 

6.根据权利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1。 

7.如权利要求1所述扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法的应用。