[发明专利]ESAT6-CFP10抗体的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及疾病诊断领域，具体涉及一种ESAT6-CFP10抗体的制备方法及其应用。

背景技术

结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，又称为痨病和“白色瘟疫”。结核菌能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，我国现有肺结核病人约500万，主要集中在25岁及以上人群，每年约有13万人死于结核病，死亡平均年龄为55.2岁。据研究，受结核菌感染的人群中，10％的人会发展为结核病。如果不采取有效的控制措施，在未来10年，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。

结核分枝杆菌RD1区编码产生两种蛋白，早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)。与致病性的结核分枝杆菌相比，卡介苗(BCG)和环境分枝杆菌，如耻垢分枝杆菌，却不表达ESAT-6和CFP10。因此制备抗ESAT6-CFP10单克隆抗体用于结核病诊断不仅能做到早期诊断，而且具有特异性强的特点，能区分致病性结核分枝杆菌感染和环境分枝杆菌感染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种ESAT6-CFP10抗体的制备方法，其制备的ESAT6-CFP10抗体可用于肺结核病的诊断，提高肺结核检测结果的准确性。

为实现上述目的，本发明采用以下方案进行实施：

一种ESAT6-CFP10抗体的制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：

S1：抗原ESAT6-CFP10对纯种BALB／c小鼠进行免疫处理，无菌操作取出脾脏，制备脾细胞悬液待用；

S2：取对数生长的SP2／0骨髓瘤细胞与步骤S1中制得的脾细胞按1∶5的比例混合，加入PEG溶液，SP2／0骨髓瘤细胞与脾细胞融合形成杂交瘤细胞并采用HAT选择培养液进行选择培养，HAT选择培养液维持7～10天后换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液培养；

S3：在步骤S2选择培养期间检测ESAT6-CFP10抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞，在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞进行增殖，产生分泌得到ESAT6-CFP10抗体。

具体的步骤为：

步骤S1中参考GeneBank中报道的ESAT6和CFP10序列设计引物，以MTB基因组为模板，PCR扩增后测序、克隆至原核表达载体pQE80L中，IPTG诱导培养，收集菌体并按照Native condition方法对目的蛋白ESAT6-CFP10进行亲和抗原纯化即可制得ESAT6-CFP10抗原。

步骤S2中在选择培养期间，每2～3天换一半培养液，杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，开始检测特异性抗体，检测采用酶联免疫吸附试验进行。

ESAT-6、CFP-10作为MTB感染早期分泌的蛋白，制备抗ESAT6-CFP10单克隆抗体用于结核病诊断不仅能做到早期诊断，而且具有特异性强的特点，能区分致病性结核分枝杆菌感染和环境分枝杆菌感染。

具体实施方式

以下结合具体实施方式来对本发明作进一步的说明，除特别说明以外，所用的试剂和材料均可以通过商业途径购买得到。

1：ESAT6-CFP10抗原制备

早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)是由结核分枝杆菌(MTB)RD1区编码产生的两种蛋白。与致病性的结核分枝杆菌相比，卡介苗(BCG)和环境分枝杆菌，如耻垢分枝杆菌，却不表达ESAT-6和CFP-10。因此制备抗ESAT6-CFP10单克隆抗体用于结核病诊断不仅能做到早期诊断，而且具有特异性强的特点，能区分致病性结核分枝杆菌感染和环境分枝杆菌感染。其方法主要是参照GeneBank中报道的ESAT-6和CFP-10序列设计引物，

ESAT-6上游引物为GCATCGATACA GAGCAGCAGTGGAATTT；

下游引物为GCGAAGCTTTCATGCGAACATCCCAGTGA。

CFP-10上游引物为GCCAAGCTTGGTGGCTCAGGTGGCTCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGATCAATGGCAGAGATGAAGACCG；

下游引物为CGCGAATTCTCAGAAGCCCCATTTGCGAGGAC。