[发明专利]一种四重RT-PCR同时检测多种大蒜病毒的方法及其引物组合

权利要求书

1. 一种四重RT-PCR同时检测多种大蒜病毒的方法，其特征在于，其步骤包括：

1）取大蒜叶片，提取其RNA；

2）以步骤1）得到的RNA为模板，通过反转录，得到cDNA；

3）以步骤2）得到的cDNA为模板，用四对引物对其进行PCR扩增；

4）PCR产物凝胶电泳，根据目的片段大小及阳性对照，判断病毒感染情况；

其中，所述引物如下：

青葱X病毒属病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；

检测洋葱黄矮病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示；

检测韭葱黄条病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.5所示；反向引物如SEQ ID NO.6所示；

检测大蒜潜隐病毒和葱潜隐病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.7所示；反向引物如SEQ ID NO.8所示。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：四重PCR检测的反应体系，按50 μl计：2× PCR mix 25 μl、模板（cDNA）4 μl、四对引物的正向引物和反向引物各2 μl、超纯水补至所需体积。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于四重PCR检测的PCR程序：92℃ 2min预变性后，40个循环参数为，92℃ 30s，42.5-45.6℃退火 30s，72℃ 1min，最后72℃ 10min。

4.按照权利要求1至3任一项所述的方法，其可以同时检测国内发现的大蒜主要病毒洋葱黄矮病毒(OYDV), 韭葱黄条病毒 (LYSV)，葱潜隐病毒(SLV)、 GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X。

5.一种用于四重RT-PCR同时检测多种大蒜病毒的引物对组合，其特征在于：其由四对引物组合而成，所述引物分别如下：

青葱X病毒属病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；

检测洋葱黄矮病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示；

检测韭葱黄条病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.5所示；反向引物如SEQ ID NO.6所示；

检测大蒜潜隐病毒和葱潜隐病毒的引物为：正向引物如SEQ ID NO.7所示；反向引物如SEQ ID NO.8所示。

6.按照权利要求5所述的引物对组合，其可以用于同时检测国内发现的大蒜主要病毒洋葱黄矮病毒(OYDV)、 韭葱黄条病毒 (LYSV)、葱潜隐病毒(SLV)、 GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X和ShV-X。

7.一种检测青葱X病毒属病毒的引物对，其特征在于：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示。