[发明专利]一种提高三角褐指藻脂质积累的培养方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种提高三角褐指藻脂质积累的培养方法。

（二）背景技术

由于石油资源枯竭、能源短缺及环境污染等问题的日益严重，故开发绿色清洁的生物燃料已成为国际研究热点。在生物燃料的众多原料中,微藻具有光合作用效率高、含油量高、生长周期短以及油脂面积产率高等特点，是最有潜力的生物质资源。

微藻产油达到真正可以替代石油成为主流燃料，第一，要在目前常用的能源微藻中寻找到一种最佳产油藻种。第二，应在实验室阶段研究如何提高微藻的生物量，主要的方法包括调整培养液配方、改变光照及温度等，同时采用合适的培养方式。研究发现微藻最适氮源是不同的，微囊藻的最适氮源为铵态氮，而富油新绿藻却为硝酸态氮；一定范围的高磷高氮能提高微藻的生物量，培养6天后，当磷浓度为80mg/L时，微囊藻生长较快，生物量大约为原培养基中磷浓度（40mg/L）时的2倍；不同微藻对光照及温度的要求不同，如斜生栅藻的最适生长温度为25℃，而铜绿微囊藻的最适生长温度为35℃。此外，通过改进藻的培养方式也可以提高藻的生物量，如采用变速流加培养技术可显著提高盐藻的生物量，当流加因子k=0.194时，变速流加比一次性培养盐藻的生物量增加约5倍。第三，应在生物量及单位微藻脂质产量之间寻找平衡点，达到总脂质含量最大化。研究发现低磷浓度下限制藻类的生长，但却有利于总脂的积累。研究发现三角褐脂藻在缺氮163小时后，总脂质积累达到正常培养条件下的16倍。

目前，绝大部分研究认为在外界N，P等营养元素缺乏时，藻细胞会随即停止生长，此时脂肪酸会大量积累，其具体分子机制还不是很清楚。发明人最新研究发现其分子机制可能与影响光合作用有关，通过调节藻细胞光合作用代谢途径，可以更大程度上积累脂质。基于以上研究，发明人提出可以通过在黑暗条件下，调节细胞内的碳流方向以便最大限度积累油脂。

（三）发明内容

本发目的是提供一种高效、简便、无污染的提高三角褐指藻脂质积累的培养方法。

本发明采用的技术方案是：

一种提高三角褐指藻脂质积累的培养方法，所述方法如下：将三角褐指藻接种至常规适用于三角褐指藻的培养基，于24±0.5℃、光暗比为12h:12h（即光照12h、黑暗12h交替）、光照强度4000lux条件下培养至OD₆₈₀=1～2，然后移至暗室中，于24±0.5℃、黑暗条件下培养80～100h，获得三角褐指藻藻液。黑暗条件抑制了藻的光合作用，从而有利于它的脂质积累，本发明优化藻种，发现三角褐指藻为最佳产油藻，在黑暗条件下，脂质积累的增加最为显著。所述适用于三角褐指藻的培养基为本领域常规用于藻类培养的培养基，可同时使用X Erdschreiber's培养基和水生-4培养基。

优选的，所述黑暗培养时间为96h，此时脂质积累量达到最大。

本发明的有益效果主要体现在：本发明在三角褐指藻处于稳定期时进行实验，使得总脂肪酸含量和每个细胞中的含量都达到最大值。本发明通过调节藻细胞光合作用代谢途径，可以更大程度地积累脂质。通过黑暗培养，既节约能源，且无污染，无有害物质产生，为当今微藻产油业注入一剂强心剂。

（四）附图说明

图1为三角褐指藻细胞通过尼罗红染色后的荧光显微镜照片（脂质可以被染色成黄色），A为常规培养条件下的藻细胞，B为黑暗条件下的藻细胞；图2为每个藻细胞中脂质含量的荧光强度比较；黑暗培养条件（b）下藻的脂质含量是常规培养条件（a）下的2倍多。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1三角褐指藻的培养

1）三角褐指藻（Phaeodatylum tricomutum）购自中国科学院武汉水生生物研究所（编号：FACHB-863），同时使用2X Erdschreiber's培养基和水生-4培养基培养。