[发明专利]一株海旋菌及制备琼胶酶的方法

权利要求书

1.一株海旋菌，其特征在于：所述海旋菌为海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-2013007，已于2013年12月25日在保藏在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏编号为 CCTCC M 2013708。

2.根据权利要求1所述的一株海旋菌，其特征在于：所述海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-2013007的16S rRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种如权利要求1所述的一株海旋菌的用途，其特征在于：用于制备琼胶酶。

4.一种如权利要求1所述的一株海旋菌用于制备琼胶酶的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）    用250mL锥形瓶装20-60mL种子培养基，按常规方法灭菌，冷却，并接种菌落，接种后于20-30℃，160rpm摇床培养12-24h后得到种子发酵液；

（2）    用250mL锥形瓶装20-60mL发酵培养基，按常规方法灭菌，冷却，并按2%-10%的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，20-30℃培养24-60h后得到含琼胶酶的发酵液；

（3）    而后将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液；

（4）    将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵进行盐析，放置冰箱过夜，4℃，8000-10000g离心20-40min取沉淀；

（5）    用缓冲液 A平衡 DEAE-Sepharose Fast Flow 柱，过 4-5 个床体积，称取 0.3g 琼胶酶粉溶于 8mL 缓冲液 A 中，6000g 离心 20min 后取上清液上离子交换柱，上样后用缓冲液 A 过 2-3 个床体积洗去没有被吸附的杂蛋白，然后用以缓冲液 A 配制的 0-0.5mol/L 的 NaCl 溶液进行梯度洗脱；流速控制在0.5mL/min，检测波长为 280nm，洗脱液分部收集，4.5mL/管，测定洗脱管峰部分的试管中溶液的酶活力，将有活性的部分合并，冷冻干燥后得酶半成品；

（6）    将 Sephcryl S-100 凝胶过滤层析柱用缓冲液 A 平衡后，称取半成品琼胶酶 0.05g 溶于 4mL 平衡缓冲液中，6000g 低温离心 20min 后取上清液上层析柱，用缓冲液 A 进行洗脱，控制流速为 0.1mL/min，洗脱液经紫外检测并分部收集，4.0mL/管，分别测定出峰部分试管的酶活力，将有活性的部分合并，经充分透析脱盐后经超滤膜浓缩，对浓缩液冷冻干燥，得成品琼胶酶。

5.根据权利要求4所述的一株海旋菌用于制备琼胶酶的方法，其特征在于：所述发酵培养基为：海盐20-30g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉0.5-2.5g/L，琼脂1.5-2.5g/L，调节pH为7.2-8.4，去离子水配制；所述的种子培养基：琼脂2g/ L，海盐30 g/L，蛋白胨5g，酵母粉1g，PH为8.0，去离子水配制。

6.根据权利要求4所述的一株海旋菌用于制备琼胶酶的方法，其特征在于：所述的缓冲液A为0.02mol/L，pH7.5 的 Tris-HCl 缓冲液。