[发明专利]嗜盐混合菌以葡萄糖为底物一步连续生产PHBV的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用微生物生产胞内聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)的方法，尤其是以嗜盐混合菌为生产者代谢葡萄糖生物一步合成生产PHBV的方法。该方法可以降低PHBV的生产成本，属于PHBV生产技术领域。

背景技术

全球范围内，由于各行业大量地使用塑料用品塑料废物的积累对环境产生了严重的威胁。为了应对这个问题，生产生物可降解材料替代以石油为原料生产的塑料成为可持续性地解决这一问题的关键。聚羟基脂肪酸脂（PHA）是典型的环境友好材料，可以100%的生物降解。PHA可以被很多微生物作为碳源和能源储存，被认为是可以替代以石油为原材料生产塑料的重要生材料。目前，商业生产PHA多以纯菌发酵进行。该方法生产PHA的成本高限制了其广泛的市场和商业应用。在影响微生物生产PHA的成本因素中，底物成本、细胞内PHA含量和后续PHA提取方法是最主要的因素。为了降低PHA的成本，需要使用廉价的底物并从工艺角度提高细胞内PHA含量。以混合菌代替纯菌生产PHA可以扩展对底物的选择范围，从而突破纯菌以乙酸为底物生产PHA的限制，选择更多廉价有机物甚至废弃物降低生产成本。

嗜盐微生物是一类生长在盐湖，盐田及晒盐场等高盐环境中的微生物。嗜盐微生物在长期高盐压力的演化中形成了适应环境胁迫的特殊细胞结构、生理机能、遗传基因和适应机制。嗜盐微生物具有PHA积累的能力，这可能是其在长期特殊生境中适应环境一种生理机制。由于嗜盐微生物生长环境中高盐浓度可以阻止其他非嗜盐微生物的生长，因此其可以减少灭菌程序，实现开放式PHA生产。目前，商业生产PHA需要严格的灭菌程序。以嗜盐微生物作为生产者生产PHA可以免除灭菌程序，降低生产成本。此外，使用嗜盐微生物生产PHA在内聚物回收上也具有显著的成本优势。由于嗜盐微生物高的内部渗透压，一旦进入淡水系统就会迅速导致细胞壁的破裂，实现快速的PHA释放。为此，利用嗜盐微生物生产PHA可以实现低成本的回收程序，进一步降低PHA提取成本。

在以混合菌生产PHA的生产工艺方面，目前普遍采用两步法实现PHA的生产。两步法生产工艺包括高聚PHA菌群筛选和PHA生产两个步骤。在这两个步骤中，分别采用不同的底物完成各自的目标。尽管两步法可以增加PHA的产量，但是该工艺无法实现连续生产和操作。由于每个过程中复杂的工艺要求，工艺控制复杂成为该方法的主要障碍。如果将两步法变成一步法，即种群富集和PHA生产在一个反应器内以相同底物完成，将突破生产上的这些障碍。为此，寻求一种简单地、可操作地、有效地微生物生产胞内共聚物PHBV的方法，降低PHA生产成本成为一种亟待解决技术需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单地、可操作地、有效地利用嗜盐混合菌作为生产者以葡萄糖为底物合成生产PHBV的方法。该方法最大可能地降低了PHA生产成本，并提高生产方法的可操作性。

嗜盐混合菌以葡萄糖为底物一步连续生产PHBV的方法，主要包括以下步骤：

步骤1，采集嗜盐混合菌接种在发酵罐中，然后向发酵罐中注满底物水溶液；

步骤2，采用间歇操作方式运行发酵罐，启动发酵罐的曝气装置，向发酵罐内匀速注入空气，控制底物溶液中的溶解氧浓度在1-3mg/L，连续运行5-8小时，发酵罐操作条件为：发酵罐恒温37±0.1℃，pH=6-8；

步骤3，排除发酵罐中75%的混合液；

步骤4，向发酵罐中注满底物水溶液；

步骤5，重复步骤2-步骤4直到微生物细胞中PHBV的质量百分含量达到30%以上；

步骤6，继续连续重复步骤2-步骤4，对步骤5之后每次排除的发酵液进行离心，收集离心后的微生物，提取PHBV。

本发明基于的硬件系统为公知的商业发酵罐。所述的嗜盐混合菌以接种河口底泥发展形成嗜盐混合菌，将海口底泥直接接种到发酵罐中。

发酵底物水溶液的成分配比：每升底物水溶液含：1.5g葡萄糖，30.0gNaCl，45.0mg MgCl₂·6H₂O，113.3mg NH₄Cl，26.0mg KH₂PO₄，7.6mg KCl，3.0mg FeSO₄·7H₂O，1.5mg ZnSO₄·7H₂O，8.0mg CaCl₂·2H₂O，1.2mg MnSO₄·H₂O，20.0mg硫脲，余量为水。