[发明专利]尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及表观遗传学研究领域，尤其是涉及一种尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用。

背景技术

慢性肾衰竭是指各种肾脏病导致肾脏功能渐进性不可逆性减退，直至功能丧失所出现的一系列症状和代谢紊乱所组成的临床综合征，简称慢性肾衰。慢性肾衰的终末期即尿毒症。尿毒症不是一个独立的疾病，而是各种晚期的肾脏病共有的临床综合征，是慢性肾功能衰竭进入终末阶段时出现的一系列临床表现所组成的综合征。

慢性肾脏疾病（CKD）是复杂的疾病，近几十年来，其发病率逐年增长，调查结果发现中国人群中CKD的发病率为11.8%—13.0%，预测在全国范围内CKD患者已超过1亿。我国的尿毒症患者在100万以上，此类患者每年治疗总费用将超过500—1000亿元，因而解决好肾脏疾病的早期预警和有效防治问题有重要的意义。目前临床上尚缺乏早期诊断手段和行之有效治疗方法，其中部分患者进展至尿毒症。CKD患者发病较隐匿，疾病的发生往往先是功能和分子的变化，继而是形态学的改变，很多患者首诊时就已经出现肾病综合征或肾小球肾炎的临床症状。因此，有必要用创新的方法寻找并发现尿毒症特异性的生物标志物。

表观遗传学是研究DNA序列没有发生改变的情况下而基因表达和表型却发生可遗传改变的学科。这种变化涉及组蛋白修饰，主要包括乙酰化、甲基化、泛素化和磷酸化。研究表明，表观遗传异常与尿毒症发病相关，表观遗传学研究的发病机制密切相关可能为阐明尿毒症的发病机制和开发新的策略来治疗这种疾病的线索。

发明内容

基于此，有必要提供一种尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用。

一种尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法，包括如下步骤：

分别采集尿毒症患者和健康人的血液样本，并从所述血液样本中提取DNA；

将所述DNA消化成200～1000bp的DNA片段，并加入76mer完全羟甲基化的寡核苷酸链作为阳性对照；

将含有所述阳性对照的所述DNA片段加热变性，再将得到的单链DNA样本分成两份，其中一份作为实验组加入抗5’-羟甲基化胞嘧啶核苷抗体得到DNA片段抗体复合物，另一份作为对照组，记为Input，其中，实验组用免疫磁珠法分离所述DNA片段抗体复合物，共沉淀后非羟甲基化的DNA片段被清洗除去，得到纯化的DNA片段抗体复合物，记为hMedIP；

对上述实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段进行扩增；

对扩增后的实验组DNA片段抗体复合物和对照组DNA片段分别使用Cy5和Cy3染料标记；

将染料标记后的实验组DNA片段抗体复合物与对照组DNA片段混合后与羟甲基化微阵列检测芯片杂交，使用hMeDIP-Chip技术对比分析尿毒症患者和健康人的芯片杂交结果，得到尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因。

在其中一个实施例中，在将所述DNA消化成200～1000bp的DNA片段之前，所述分析方法还包括对提取的DNA使用NanoDrop ND-100分析仪测定所述DNA的数量和质量以及用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性的步骤。

在其中一个实施例中，在对上述实验组纯化的DNA片段和对照组的DNA片段进行扩增之前，所述分析方法还包括对免疫磁珠法分离得到的DNA片段抗体复合物的富集效率进行评估的步骤。

在其中一个实施例中，所述使用hMeDIP-Chip技术对比分析尿毒症患者和健康人的芯片杂交结果包括如下步骤：

使用高解析度芯片扫描仪分别检测尿毒症患者组与健康人的芯片杂交信号，获取Cy3及Cy5的荧光扫描图像；

使用Bioconductor packages Ringo、limma及MEDME对杂交结果进行数据提取、标准化和峰值分析；

经过校正得到所述羟甲基化微阵列检测芯片上每个检测探针的log2(hMeDIP/Input)值以及p-value值，log2(hMeDIP/Input)值代表每个探针在实验组纯化的DNA片段抗体复合物和对照组的DNA片段中的相对富集强度，p-value表示探针红绿信号差异是由非生物因素造成的概率，p-value由修正的KS检验算法计算。

在其中一个实施例中，所述分析方法还包括在筛选得到所述尿毒症羟甲基化状态的差异表达基因之后针对筛选得到的差异表达基因使用实时荧光定量PCR对hMeDIP-Chip分析结果进行验证的步骤。