[发明专利]一种尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的超高效液相色谱测定方法

说明书

 

技术领域

本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，具体来说是一种采用超高效液相色谱仪测定尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量的分析测定方法。

背景技术

苯乙烯是塑料橡胶工业的重要原料，它是无色油状液体，有芳香气味，用以制造各种塑料树脂，合成橡胶。日常生活和工业生产中广泛使用的含有苯乙烯的塑料橡胶制品，如各种包装材料、隔热材料、一次性饭盒、纸杯、管道、容器等。苯乙烯还存在于卷烟烟气中，苯乙烯主要以气体形式通过呼吸道，或通过皮肤接触进入人体，对眼和上呼吸道粘膜有刺激和麻醉作用，短时间接触高浓度苯乙烯可引起咳嗽、咽痛等呼吸道刺激症状；长时间接触苯乙烯可引起肺组织结构损害，从而使人易患肺炎、肺气肿等疾病。国际癌症研究组织将其列为Group 2A，即对人类为很可能致癌物，对动物则为确定之致癌物。吸入体内的苯乙烯在CYP2B6和CYP2E酶的作用下代谢为苯乙烯7，8-氧化物，苯乙烯7，8-氧化物在环氧化物酶的作用下进一步代谢为苯乙醛酸和苯乙醇酸，苯乙醛酸和苯乙醇酸（两者结构式如下），目前已经被用作苯乙烯暴露的生物标志物。

目前，分析尿液中苯乙烯的代谢物—苯乙醛酸和苯乙醇酸的方法主要有：液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法和液相色谱串联质谱法。由于尿液基质比较复杂，采用液相色谱的方法检测往往需要经过复杂的前处理来净化样品，而且分析时间长，不适用于大规模检测；气相色谱质谱方法需要先对样品进行衍生化处理；而液相色谱串联质谱虽然灵敏度高、检测限低，但价格昂贵，不利于普及，应用范围窄。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，建立一种简单、快速、选择性好的测定尿液中的苯乙醛酸和苯乙醇酸的超高效液相色谱的方法，具体是采用超高效液相色谱仪测定尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量的方法，该方法能快速、准确检测尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸的含量，测定结果准确、测定干扰少，分离分析时间短。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：尿液中苯乙醛酸和苯乙醇酸含量的测定方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：

a、收集志愿者尿液。

b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，经过0.22 μm的水相滤膜过滤，取1.0 mL的尿液，加入1.0 mL 6 mol/L的盐酸和4.0 mL混合萃取溶液（二氯甲烷：异丙醇，9:1），2000 r/min振荡提取3分钟，10000 r/min离心1分钟，取下层有机相1.0 mL，于40℃氮吹至干，加入0.2 mL流动相复溶，取5 μL引入超高效液相色谱仪分离分析。

c、标准工作液配制：用纯水配制不同浓度的苯乙醛酸和苯乙醇酸混合标准工作溶液，浓度分别为0.085，0.17，0.425，0.85，4.25和8.5 μg/mL和0.25，0.5，1，2，10和20 μg/mL。

d、超高效液相色谱（UPLC）测定，吸取配制好的不同浓度的苯乙醛酸和苯乙醇酸混合标准工作溶液，注入超高效液相色谱系统，苯乙醛酸和苯乙醇酸的线性回归方程分别为y = 1.12×10⁵x+1.36×10⁴和y = 1.94×10⁴x－2.48×10³，其中y代表目标分析物的峰面积，x表示尿液中目标分析物的浓度。相关系数均大于0.9990，对样品待测液进行测定，得到分析物的色谱峰面积，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

本发明中选取Waters ACQUITY UPLC^? BEH色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相体系为甲醇：0.01%混合酸水溶液（15:85）；等度洗脱；流动相流速150 μL/min；分析时间为8 min；进样量为5 μL。

超高效液相色谱检测器条件：光电二极管阵列检测器，检测波长：225 nm、254 nm；柱温箱温度：30℃。

本发明方法的线性范围和检出限：