[发明专利]一种大田马铃薯植株氮素营养分子诊断方法及在施肥上的应用

权利要求书

1.一种大田马铃薯植株氮素营养分子诊断方法，其特征在于，以马铃薯植株氮素吸收相关的硝酸还原酶基因NR的表达量来确定诊断大田马铃薯植株氮素营养状况。

2.根据权利要求1所述的大田马铃薯植株氮素营养分子诊断方法，其特征在于，以肌动蛋白基因Actin基因为内参，采用Real time PCR方法检测硝酸还原酶基因NR的相对表达量，以判断大田马铃薯植株氮素营养状况。

3.根据权利要求1所述的大田马铃薯植株氮素营养的分子诊断方法，其特征在于，Real time PCR中用于扩增NR基因的引物的序列为：正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的大田马铃薯植株氮素营养的分子诊断方法，其特征在于，作为内参基因的Actin基因的扩增引物为: 正向引物如SEQ ID NO.3所示；反向引物如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求1至4任一项所述的大田马铃薯植株氮素营养的分子诊断方法，其特征在于包括如下步骤：

1）马铃薯植株叶片RNA的获得：田间取马铃薯植株顶端第一片完全展开叶,通常是第四片叶,液氮处理并带回实验室,采取trizol方法提取RNA；

2）以步骤1）得到的RNA为模板，通过反转录，得到cDNA；

3）以步骤2）得到的cDNA为模板，进行Real time PCR扩增；

4）通过分析、计算得出NR基因的相对表达量，根据拟合公式计算施氮量。

6.根据权利要求1至5任一项所述分子诊断方法在大田马铃薯植株施用氮肥中的应用，其特征在于，

第一步，根据权利要求1至5任一项所述的大田马铃薯植株氮素营养的分子诊断方法得到硝酸还原酶基因NR的相对表达量，

第二步，根据第一步所得到的表达量确定大田马铃薯植株氮素营养状况，并确定是否施用氮肥或其施肥量，

第三步，对所述大田马铃薯植株施用确定的氮肥。

7.根据权利要求5所述的大田马铃薯植株氮肥的施肥方法，其特征在于，

第二步确定施氮量N按公式计算得到：N=-6.7891*ΔCt²-37.622*ΔCt-43.033

其中,施氮量N单位为纯N kg/667m²，且当N大于零时，需追施氮肥，当N小于零时，不用追施氮肥；ΔCt = Ct_NR-Ct_Actin，Ct_NR和Ct_Actin 分别表示硝酸还原酶基因NR和内参基因肌动蛋白基因Actin在 Real time PCR扩增过程中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数。

8.根据权利要求7所述的大田马铃薯植株氮肥的施肥方法，其特征在于，施用确定的氮肥按下述拟合公式计算得到：N=-6.7891*ΔCt²-37.622*ΔCt-43.033，其中施氮量N的单位为纯氮kg/667m²。