[发明专利]一种用于梅花鹿皮肤松弛相关基因Fibulin-5基因点突变的检测试剂盒

说明书

 技术领域

本发明属于基因突变检测领域，具体涉及一种梅花鹿皮肤松弛相关基因Fibulin-5基因c.1030C>T和c.1081C>T突变的PCR检测试剂盒。

背景技术

人类皮肤松弛症是世界罕见疾病之一，是一种获得性和遗传性结缔组织异质性疾病，其特征是松散、多余的皮肤皱褶、下垂和弹性下降等。皮肤松弛症的患者皮肤容易松弛有褶皱，看起来未老先衰。皮肤松弛病征包括X-连锁、常染色体显性和隐性形式。而梅花鹿皮肤松弛症更加罕见。且这种梅花鹿产茸量极高，常常被用来作为种公鹿，但是在发情季节后颈部皮肤松弛更加严重，下垂很明显。一般认为，皮肤松弛症与遗传物质的改变有关。

Fibulin-5(FBLN-5)亦称为DANCE(developing arteries and neural crest EGF-like)或EVEC(embryonic vascular EGF-like repeat-containing protein)，是Fibulin家族中的最新成员，是一个6.6万道尔顿的分子，是钙依赖性弹性蛋白结合蛋白，位于弹性蛋白-微纤维表面。在弹性纤维形成过程中发挥决定性作用。FBLN5基因，定位于人染色体14q31，广泛分布于富含弹性蛋白的组织里，属于整合糖蛋白，是一种细胞外基质蛋白，由448个氨基酸组成，有5个潜在的钙结合性表皮生长因子（EGF）样结构域。与αvβ3和αvβ5整合蛋白相互作用的特定细胞附着序列RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸arginyl-glycyl-aspartic acid）位点，位于N-末端不规则EGF域，将原弹性蛋白锚定于细胞表面，这对形成弹性纤维十分关键。Fibulin-5是弹性纤维发育过程中不可缺少的基因，在弹性蛋白聚合过程中，Fibulin-5作为弹性蛋白交联排列的支架，促进弹性蛋白交联形成弹性纤维。弹性纤维90%组分为原弹性蛋白，Fibulin-5能直接与原弹性蛋白结合，而原弹性蛋白还能促进Fibulin-5的表达。 

Fibulin-5基因突变可以引起常染色体显性或者隐性遗传皮肤松弛症。如：人类皮肤松弛症患者Fibulin-5基因外显子7的纯合子n.679T>C的突变，在fibulin-5蛋白第四个EGF样结构域产生一种丝氨酸和脯氨酸代替物（p.S227P）；外显子9的n.945T>C（rs2430347），改变了异亮氨酸315的编码，从ATT到ATC。 

发明内容

 本发明的目的在于，提供一种检测梅花鹿皮肤松弛症相关基因Fibulin-5基因突变的试剂盒，可用于检测Fibulin-5基因c.1030C>T和c.1081C>T突变位点。

检测梅花鹿皮肤松弛相关基因Fibulin-5基因突变的试剂盒，其特征在于，包括：（1）PCR扩增反应试剂：包括dNTP、10×PCR缓冲液、Mg²⁺、双蒸水、Taq酶等；（2）用于扩增样本cDNA中Fibulin-5基因突变位点1030和1081C>T的PCR引物上游引物F778：5’-ACACCGAAGGAGGCTACAC-3’，R1307：5’-CTCCTCACAGCGGATGGG-3’。 

进一步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：（1）采集梅花鹿皮肤进行成纤维细胞培养后，提取总RNA，反转录为cDNA；（2）以该cDNA为模板，用所述用于扩增样本cDNA中Fibulin-5基因的PCR引物进行PCR扩增，PCR反应按以下条件进行扩增：94°C 5min；94°C 3Os,54°C 30s,72°C 1min、30个循环；72°C 7min。得到PCR反应产物；（3）对PCR反应产物测序，与Fibulin-5正常基因序列进行比较，确定是否存在第1030和1081位核苷酸发生C>T突变。 

本发明试剂盒中用于扩增Fibulin-5基因的PCR引物，其中正向引物Fibulin-5的3’末端位于如序列SEQ ID NO.1所示的Fibulin-5基因编码区上游778bp处，反向引物Fibulin-5的3’端位于该编码区的下游约1307bp处，正反相引物大小分别为19bp，18bp，并能扩增梅花鹿Fibulin-5基因编码区495bp。 

上述引物通过如下的方案进行设计：使用Primer 5软件协助设计引物，通过PCR扩增，将Fibulin-5编码区495bp扩增，然后进行直接测序，通过测序检测1030和1081C-T位点是否发生突变。