[发明专利]一种检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像探针及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像探针及其构建方法和应用。

背景技术

细胞凋亡，是生物体内一种生理性的程序性细胞死亡过程，为细胞死亡的一种特殊方式（另一种为细胞坏死），是细胞针对所处环境因素的特定改变而产生的应答。常规的细胞凋亡检测方法都为体外检测法，诸如电子显微镜形态学观察、DNA电泳、流式细胞术、酶联免疫吸附法等，但这些方法自身多少都存在局限性。比如，标本处理过程复杂，只能定性，不能定量，并且均具有创伤性，通常只能在某一特定时间点研究细胞凋亡，不能连续动态监测凋亡在活体内的发生与发展过程。

分子成像可以无创、重复的提供活体、实时、动态、可视化的分子或基因信息，同时进行定量研究，所获得的数据与常规研究手段所得到的数据比较，更加接近机体的真实情况。近年来，随着分子影像技术的不断发展，人们逐渐将分子影像学应用于细胞凋亡研究，这种方法克服了体外细胞凋亡检测方法的局限性，为活体内细胞凋亡的基础与临床研究开创了一条全新的无创伤性研究手段。分子成像技术主要包括正电子发射计算机断层成像（Positron Emission Tomography,PET）,单光子发射计算机断层成像（Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT），磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI），光学成像和超声分子成像等。然而，MRI和超声成像由于灵敏度较低，光学成像由于穿透力和断层分辨率较低，其应用受到一定限制。SPECT由于具有较低分辨率，其应用也受到一定限制。与其他分子成像技术相比，PET具有高灵敏度和断层分辨率、标记药物半衰期短且不改变原药物的药理活性等显著优点，从而称为活体内检测细胞凋亡的最佳技术。

单纯疱疹病毒1胸苷激酶（herpes simplex virus1-thymidinekinase,HSV1-TK）报告基因是应用较广的PET成像的分子探针。其原理基本为，正电子核素标记的核苷类似物如¹⁸F-9-[4-氟-3-(羟甲基)-丁基]鸟嘌呤(¹⁸F-9-[4-F-3-hydroxymethybuty]-guanine,¹⁸F-FHBG)经主动运输通过HSV1-TK转染细胞后，被该基因的编码产物胸甘激酶（thymidine kinase，TK）磷酸化为5’-磷酸核苷，5’-磷酸核苷不能再次穿过细胞膜而陷入被转染细胞中。因而，细胞内的放射性活度反映了TK基因的表达。因此，通过构建HSV1-TK的分子影像探针，可以通过PET成像活体内监测细胞凋亡的发生发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的基于HSV1-TK的分子影像探针及其构建方法，用于活体监测细胞凋亡的发生发展。

本发明的技术方案如下：

一种检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像探针的构建方法，包括以下步骤：（1）用限制性内切酶HindIII和XhoI酶切载体pcDNA3.1，使其线性化；（2）PCR扩增蛋白内含子DnaE的C端DnaEc、TK基因的C端TKc、TK基因的N端TKn、DnaE的N端DnaEn，以及公司化学合成DEVD序列，其序列为5’-gatgaagtcgac-3’；（3）通过基因重组技术将上述各个片段DnaEc、TKc、DEVD、TKn、DnaEn依次与线性化的pcDNA3.1载体重组；（4）重组载体经过转化、提取质粒、酶切鉴定，获得HSV1-TK探针。

所述的构建方法构建的检测细胞凋亡的HSV1-TK分子影像探针，其包含启动子、蛋白内含子DnaE的C端，TK基因的C端，DEVD序列，TK基因的N端，蛋白内含子DnaE的N端，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的HSV1-TK分子影像探针在活体监测细胞凋亡的发生发展中的应用。