[发明专利]一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗及其制备方法。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的鸭病称为鸭传染性浆膜炎（infectious serositis），是感染鸭、鹅等多种禽类的一种急性或慢性接触性性传染病，鹅感染后曾被称为鹅流感或鹅渗出性败血症，具有较高的发病率和死亡率。鸭疫里默氏杆菌病在我国普遍流行，几乎遍布了所有养鸭地区，给养鸭业的发展造成了极大的损失，特别是对西部地区蓬勃兴起的养鸭业带来了严峻的威胁。

目前，我国对鸭疫里默氏杆菌病的控制主要采取药物为主，因其具有多种血清型，而各种不同血清之间无交叉保护性，故全国没有的统一的灭活疫苗，针对地区研发出的各种疫苗也只能对相应的地区有局部有效果，都存在一定的不足，灭活疫苗免疫效果不佳，需用剂量较大，只能提供短暂保护。而DNA疫苗又称裸疫苗，是继灭活疫苗、减毒活疫苗和基因工程重组蛋白疫苗之后的第三代疫苗，目前已用于HIV、流感病毒、恶性疟原虫等多种病原体感染性疾病的防控，并取得了积极的进展。

据研究资料显示，鸭疫里默氏杆菌病毒OmpA基因所编码的OmpA蛋白是目前各地区各血清特异性强的结构蛋白，具有较强的抗原性，能诱导鸭细胞免疫和体液免疫应答反应，产生特异性中和抗体和各种细胞因子，在鸭疫里默氏杆菌病的预防与控制上发挥重要作用。关于基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗少见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，提供一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗及制备方法，该疫苗能诱导鸭产生良好的体液免疫应答，且不引起鸭产生不良反应，具有良好的生物安全性。

本发明的技术内容：

一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗，含鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-OmpA，质粒浓度为2mg~5mg/mL，该真核表达质粒含有鸭疫里默氏杆菌OmpA的全基因编码序列，该基因的长度为1164个核苷酸，类型为核苷酸，全长为编码区。

一种基于OmpA基因鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：

第一，培养鸭疫里默氏杆菌贵州三穗分离株，采用DNA提取试剂盒或煮沸法提取细菌DNA，进行PCR目的基因扩增；

第二，将获得的目的基因片段连接于pMD-18T载体，构建pMD-18T-OmpA，再转入大肠杆菌DH5α中；

第三，采用PCR方法从pMD-18T-OmpA扩增出OmpA基因，用HindⅢ＋BamHⅠ进行酶切，同法处理真核表达载体pcDNA3.1(+)，然后电泳分离和分别回收目的基因；

第四，采用T₄ DNA连接酶将鸭疫里默氏杆OmpA基因插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选，挑取可疑菌落于LB液体培养基于36℃~38℃培养12~18h，收集菌液采用DNA提取试剂盒提取质粒，用PCR和双酶切进行鉴定；

第五，取鉴定为阳性重组质粒的大肠杆菌DH5α，于LB液体培养基36℃~38℃培养12~18h后，采用大剂量质粒提取试剂盒提取得到pcDNA3.1(+)-OmpA，即为基于鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗。

本发明有益效果：本发明方法适用于鸭的免疫接种，防制鸭疫里默氏杆菌病的发生与流行，同时具有良好的经济效益和生态效益。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

(1) 免疫效果良好：本发明所采用真核表达载体pcDNA3.1(+)构建的鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗，肌肉注射动物后能诱导鸭产生良好的体液免疫应答，且真核表达质粒不易降解，性能稳定，免疫效果持续时间长。

(2) 制备成本较低：本发明的DNA疫苗在需要时，只需将含重组质粒pcDNA3.1(+)-OmpA的大肠杆菌DH5α进行大量培养后，提取重组质粒pcDNA3.1(+)-OmpA即可。

(3) 免疫接种方便：本发明的DNA疫苗采用肌肉注射进行接种，操作方便，不像其他灭活疫苗要求皮内或皮下注射。

(4) 安全无副作用：本发明的DNA疫苗不会引起毒力增强或导致基因整合，也不会引起鸭发生其他症状。

附图说明

图1为本发明的鸭疫里默氏杆菌DNA疫苗的制备流程图。

具体实施方式