[发明专利]用于二恶英类物质生物检测的重组载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组载体，具体涉及一种用于二恶英类物质生物检测的重组载体以及包含该重组载体的细胞。本发明还涉及所述重组载体和细胞在二恶英类物质生物检测方面的用途。

背景技术

二恶英（Dioxin）是持久性有机污染物（POPs）的一种，以其强烈的毒性及对生物体巨大的危害而被称为“世纪之毒”。

就目前二恶英的检测方法而言，一般来说有两大类方法，即仪器分析法和生物分析法。上世纪90年代美国环境保护局公布的检测二恶英的标准方法US EPA Method1613和1618界定了用高分辨气相色谱-高分辨质谱（HRGC-HRMS）联机检测二恶英，该方法也被公认为是鉴定和定量二恶英的“黄金标准”方法。这种方法虽然准确，但是成本高，检测周期长，而且需要一定的专业技术人员，因此限制了这种方法的的应用性。

而生物检测方法普遍具有价格低廉、高通量和便于推广应用等特点，近年来在全球范围内得到了飞速的发展和应用。如果从所使用的检测体系来分类，生物检测方法大致可以分为体内法和体外法两大类。体内法是利用活体动物，比如说小鼠、斑马鱼等等，通过检测其生物学标记物表达的变化或其生理指标的变化来检测二恶英类化合物。虽然任何化合物毒性的最后确定都需要体内法，但这种方法费时费力费钱，并不适合大规模筛查。第二大类，就是体外法。简单的讲就是脱离动物活体，以细胞或者抗体等简单的手段检测二恶英的含量，狭义地讲二恶英的生物分析方法就是指的体外法。在体外法中，又可以根据其基本原理分为两大类：一类是基于二恶英毒性信号通路的，主要包括基于CYP1A1酶活的EROD法、和基于报告基因的CALUX法；另外一类是基于二恶英抗体酶联免疫反应的，包括酶联免疫测定法（ELISA）、荧光免疫测定法（DELFIA）等。而CALUX是这些生物检测方法中最灵敏的，也是其中具有代表性的检测方法之一。

CALUX法灵敏度高、通量高、便于操作，已在很多国家和地区得到了实际应用。目前发达国家包括美国、欧盟、日本相继建立和完善了各国自己的基于该方法的标准，例如US EPA Method4435；EU Commission Regulation NO1883/2006等等。目前CALUX技术的最低检测阈值（MDL）已经可以达到1pM，而半数效应浓度（EC50）则已经达到20pM，已经达到了仪器分析的灵敏度，显示了其良好的应用价值。

CALUX法的基本原理是：二恶英进入细胞后与细胞质内的芳香烃受体（AhR）结合并活化该受体，活化的AhR进核并与芳香烃受体核转位蛋白（ARNT）结合，而后AhR:ARNT异源二聚体可以直接充当转录因子结合于一些基因启动子区中的二恶英反应元件（DRE）上从而调控这些基因的表达水平。在这些基因中，CYP1A1是目前公认的二恶英反应标记物。所以将CYP1A1启动子中的富含DRE的区段克隆下来，并插入到小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）启动子的调控区域，最后把这个重组启动子构建于报告基因上游，那么二恶英就可以诱导报告基因的表达了，这就是CALUX法的基本原理。

CALUX使用MMTV作为重组启动子的骨架既有优点又有缺点，优点是MMTV本身是强启动子所以在一定程度上可以放大二恶英反应的信号，缺点是MMTV启动子区域很长，可能还会受到未知其他转录因子的调控，增加了该生物检测系统的不确定性。而且在实际应用中，人们的确发现了利用该系统检测一些环境样品时其报告基因反应值高于饱和浓度二恶英标准品2,3,7,8-四氯二苯并二恶英（TCDD）的反应值，这表明一些环境样品中的确存在一些未知的化合物通过活化MMTV区段或其他区段而诱导了报告基因的表达。

根据二恶英类物质生物检测的现状并结合我国检测设备和水平较落后的具体情况，仍需开发成本低廉、灵敏度高以及克服现有系统缺陷的二恶英类物质生物报告检测方法。

发明内容

本发明的发明人经过大量实验，提供了改进的二恶英类化合物生物报告检测载体和细胞，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及重组载体，所述载体沿着其基因转录的方向可操作地连接有CYP1A1启动子及报告基因，所述启动子调节该报告基因的转录。

根据本发明第一方面任一项的重组载体，其中所述的CYP1A1启动子为哺乳动物CYP1A1启动子，例如为小鼠、豚鼠或人的CYP1A1启动子。在本发明的实施方案中，所述CYP1A1启动子为小鼠CYP1A1启动子。

根据本发明第一方面任一项的重组载体，其中所述CYP1A1启动子的序列例如为SEQ ID NO：3所示的序列。