[发明专利]高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法与装置

说明书

技术领域

本发明属于光谱测量技术领域，涉及一种高空间分辨双轴差动共焦图谱显微成像方法与装置，可用于各类样品的三维形貌重构及微区光谱探测。

技术背景

自从1990年G.J.Puppels等在Nature期刊报道其发明共焦拉曼光谱显微技术并成功用于观测单细胞和染色体的形态与组成,共焦拉曼光谱显微技术迅速发展为一种极其重要的样品结构与成分分析的基本手段。该技术既继承了共焦显微术的高分辨层析成像特征，又可以对样品进行光谱分析，因而使激光共焦拉曼光谱显微技术在光谱测试领域独树一帜，并且迅速发展为一种极其重要的样品结构与成分分析的重要手段,使之广泛应用于化学﹑生物学﹑医学、物理学﹑地质学、法庭取证、刑侦学等学科的前沿基础研究中。

但是，由于受到“零视场”扫描成像方式和衍射极限的限制，传统共焦显微系统通常难以兼顾分辨能力、工作距离和视场。增大物镜的数值孔径可以改善共焦显微系统的分辨力，但数值孔径的增大反过来又制约了共焦显微系统工作距离的增大及视场范围的扩展。且大数值孔径物镜的尺寸通常在厘米量级，不利于系统的小型化。因而，1994年Stelzer等人提出了双轴共焦显微术，将照明光轴和测量光轴正交放置，对原有共焦显微光路进行了改进，实现了大工作距离、大视场和低数值孔径物镜的高轴向分辨力显微成像，及系统的小型化。

传统的激光共焦拉曼光谱仪采用单轴显微系统，导致瑞利散射光光强过大，降低了生物样品的可观测性，根据瑞利散射定则，当入射光与散射光方向垂直时，瑞利散射光强最弱，有利于系统观测高散射性的生物样品。国内外学者利用此特性，提出双轴共焦显微结构并广泛应用于生物领域，取得了一系列成果。例如，1999年，美国Wellman实验室和Schepens眼科研究中心的Webb和Rogomentich在《Confocal microscope with large field and working distance》中提出了一种使用相对较小数值孔径物镜的双轴共焦显微系统，两个光轴的夹角小于90°，该系统实验光路的工作距离可达20mm，非常适合用于活体细胞学领域；2003年，美国斯坦福大学的Thomas Wang等人在《Dual-axis confocal microscope for high-resolution in vivo imaging》中将光纤和MEMS器件引入到双轴共焦显微成像系统中，研制出小型化的三维双轴共焦显微镜，用于高分辨力的医学活体成像；2008年，美国斯坦福大学研究小组研制成功两种规格的双轴共焦显微系统，封装直径分别为10mm和5mm，均可用于对非活体和活体成像。双轴结构的出现为活体样品的探测提供了解决途径，但是现有双轴技术仍不能满足现代科技对光谱探测技术的需求。

由于拉曼散射光十分微弱，为了降低拉曼光谱的能量损失，现有共焦拉曼技术中用于焦点定位的针孔尺寸通常较大，直径为150～200μm之间，而扩大针孔尺寸则会增加共焦轴向定位曲线的半高宽，降低其定位精度，不能很好的起到定焦作用。但是，现代科技的快速发展对微区光谱探测能力及空间分辨探测能力提出了更高的要求，若要提高空间分辨力及光谱探测能力，必须对系统进行精确定焦。在光学探测系统中，焦点处的测量聚焦光斑尺寸最小，激发光强最强，因此为了获得高空间分辨力和最优的光谱探测能力，必须使测量聚焦光斑位于焦点位置。

在差动共焦光路中，要求针孔、探测器中心与测量系统光轴重合，从而保证被测样品反射回的光束可以恰好进入探测器，但是，由于针孔尺寸较小，通常在10μm左右，使得针孔调节会有一定困难。另外，差动共焦光路中，两针孔的最优化轴向离焦量与物镜数值孔径N.A.相关，对于光路装调好的针孔位置只适用于特定的物镜N.A.，因而，无法根据样品更换物镜，从而导致差动共焦光路在实际应用中存在较大的局限性。

此外，拉曼散射光极其微弱，只有瑞利光束强度的10^-3～10^-6倍，而现有共焦拉曼光谱探测仪器只利用了微弱的拉曼散射光进行光谱探测而遗弃强于拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光束，因而，在共焦拉曼光谱探测中如何改善光路结构从而提高拉曼散射光收集效率及利用现有光谱探测系统中遗弃的瑞利光束进行辅助探测是改善共焦拉曼光谱探测技术空间分辨力的新途径。