[发明专利]鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法

权利要求书

1.鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于鉴定方法按以下步骤进行：

一、用¹⁵N标记ANAMMOX反应器内的游离态氨，用¹³C标记ANAMMOX反应器内的有机物，然后厌氧氨氧化反应10～100小时，之后终止反应，离心分离获得微生物样品，将微生物样品放置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中固定；

二、用步骤一微生物样品制备透射电子显微镜样品，然后进行TEM观察；

三、根据步骤二TEM观察结果选择目标微生物分布均匀的位置，利用切片机切片成半薄切片，放置于导电硅片上，经固定、烘干后再次喷金覆盖，得到导电样品；

四、利用纳米二次离子质谱技术扫描步骤三制备的导电样品中的标记元素，获得NanoSIMS图片；若¹⁵N标记富集的区域中有¹³C明显富集，则该反应器内的ANAMMOX菌可以利用有机物；若¹⁵N标记富集的区域中没有¹³C富集，则该反应器内的ANAMMOX菌不能利用有机物。

2.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤二透射电子显微镜样品按以下步骤制备：

A、从2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中取出样品，然后用0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再用1%锇酸固定液固定2～3小时，而后用0.1mol/L磷酸漂洗液漂洗三次，每次15分钟；再在4℃条件下用梯度浓度为50%、70%、90%、95%的乙醇溶液对样品依次进行脱水处理，每种浓度处理15分钟；之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分别脱水三次，每次15～20min，然后在室温下放入浓度为100%的丙酮中脱水三次，每次15～20min；

B、用纯丙酮与包埋液的混合液对步骤A处理后的样品室温处理3～4小时，然后37℃下纯包埋液包埋2～3小时、60℃固化5小时、再80℃固化24小时；

C、切片；

D、用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色切片，即完成透射电子显微镜样品；

步骤A中乙醇丙酮混合液由浓度为90%的乙醇和浓度为90%的丙酮按1:1的体积比混合而成；

步骤B纯丙酮与包埋液的混合液中纯丙酮与包埋液的体积比为2:1。

3.根据权利要求2所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤C中切片厚度为50～60nm。

4.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤三中半薄切片的厚度为500～1000nm。

5.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤三中导电硅片为喷金的玻璃片。

6.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤三中喷金覆盖厚度为8～12nm。

7.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤一中厌氧氨氧化反应时间为10～50小时。

8.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤一中厌氧氨氧化反应时间为15～30小时。

9.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤一中厌氧氨氧化反应时间为20小时。

10.根据权利要求1所述的鉴定ANAMMOX反应器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有机物的方法，其特征在于步骤一中用¹³C标记的有机物为甲酸、乙酸、丙酸、丙酮、苯或其衍生物。