[发明专利]重组多刺激分子细胞及其制备方法和在NKT细胞扩增中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域及疾病免疫治疗领域，具体涉及一种重组多刺激分子细胞及其制备方法和在NKT细胞体外扩增中的应用。

背景技术

重组多刺激分子细胞的制备原理是模拟T 细胞活化的双重信号机制，在一定的载体表面展现抗原肽- MHC 分子复合物及共刺激分子、黏附分子的配体或抗体构建而成，它能有效活化和扩增抗原特异性 T 细胞，而且效率高、可行性好。

目前用于制备重组多刺激分子细胞的载体主要有磁珠、细胞和脂质体三类，以磁珠为载体构建重组多刺激分子细胞虽然来源方便，但价格昂贵，应用于体内，会引起铁中毒，约束了其医疗应用前景；以脂质体为载体制备过程较为繁琐，成本较高，涉及脂质材料的购买、不同孔径大小脂质体的形成及确定等等步骤，且每次应用时必须从头开始制备，限制其广泛应用。

CD64 是特异性的细胞毒剂的传递者，CD64组成性表达于单核细胞、Mφ及DC细胞；IFN-γ可明显上调单核细胞CD64的表达，并可诱导中性粒细胞和嗜酸性粒细胞CD64的表达；CD64是高亲和力的Ig Fc-gamma 受体（FcγR?），可介导ADCC，通过IgG的调理促进对颗粒性抗原的吞噬作用，增加吞噬细胞释放IL-1/IL-6和TNF-α等细胞因子；CD64结合Ig Fc段后参与信号的传递。

CD137是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员，主要参与T细胞的扩增，生成与发育，也可以诱导外周血单核细胞的增殖，在TCR/CD3诱导下可促进T细胞的凋亡，同时可以调节与CD28共刺激的Th1细胞应激反应。TRAF受体蛋白可以与它相互作用，引导信号通路转向NF- κB的激活；CD137L 就是与CD137相互作用的蛋白，利用外源表达载体转染ME64细胞，使CD137L蛋白以及IL-18得以表达，获得的重组多刺激分子细胞，可以很好的与NKT细胞相互作用，增强NKT细胞的肿瘤细胞靶向杀伤性。

在免疫调节过程中，mIL-18可以抑制癌症发生，它可以与mIL-12协同作用，诱导Th1细胞生成INF-γ作用于肿瘤细胞；同时，协同mIL-15或者单独作用，诱导T淋巴细胞的杀伤作用或杀伤性T淋巴细胞的活化；与mIL-12一起可以诱导mIL-13或者其它T淋巴细胞因子的生成。

NKT细胞（natural killer T细胞，一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群）是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故称之为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点；因此，应用NKT细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

NKT细胞中的效应细胞CD3+和CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%—5%，因此如何在体外有效的扩增出大量杀伤力强、数量多的NKT细胞成为临床应用的关键。目前，现有的NKT细胞的体外扩增主要应用外源性细胞因子，如抗CD3McAb和IL-2等，而在肿瘤细胞杀伤过程中，增强NKT细胞的靶向杀伤性以及杀伤效力，显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组多刺激分子细胞及其制备方法，解决现有技术中重组多刺激分子细胞制备过程复杂、成本高及重复性差的问题。

本发明的另一目的是提供上述重组多刺激分子细胞在NKT细胞体外扩增中的应用，该重组多刺激分子细胞可刺激NKT细胞的大量扩增，抑制NKT 细胞的凋亡，提高NKT细胞的增殖次数及肿瘤细胞杀伤毒性。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

提供一种重组多刺激分子细胞，其为能在人急性髓系白血病细胞MEG-01细胞表面稳定表达CD64、CD137L和mIL-18的细胞 ，即ME64/CD137L/mIL-18细胞。

制备上述重组多刺激分子细胞的方法，包括以下步骤：

a、构建CD64真核表达载体，将该载体转染MEG-01细胞，再经筛选，分选，获得能够在MEG-01细胞表面稳定表达CD64的细胞，即ME64细胞；

b、制备双表达CD137L和mIL-18共刺激信号的真核表达载体；

c、将步骤b制得的真核表达载体转染所述ME64细胞，再经筛选，分选，获得能够在ME64细胞表面稳定表达CD137L和mIL-18的细胞，即ME64/CD137L/mIL-18细胞。