[发明专利]一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法

权利要求书

1.一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，包括：

（1）样品采集和DNA制备：

剪取大竹蛏的腹足，采用传统的酚氯仿法提取基因组DNA；

（2）微卫星引物的合成：

通过磁珠富集法构建大竹蛏微卫星富集文库，克隆测序其中的微卫星序列，用Primer5软件设计大竹蛏不同位点的微卫星正反向引物并合成；

所述的正反向引物如下：

SgSSR1017-F：ATAAAATGGTGAGGGTTG；

SgSSR1017-R：AACTTCACACAAAATAACTGCTA；

SgSSR0804-F：TCATCTACCATCCCACCC；

SgSSR0804-R：CTTTATTCAGTTTTCCTACGCT；

SgSSR1123-F：TCAACCTATGTTACCCTTATAC；

SgSSR1123-R：CTTCAGTTAGATTAGGAGCA；

SgSSR1103-F：TTTCAGTAATAAAGCGACC；

SgSSR1103-R：AACTCTGGTAAGAAGGATTG；

（3）PCR扩增：

运用优化好的PCR扩增体系和扩增程序对不同大竹蛏个体进行4重PCR扩增；

（4）产物检测：

PCR扩增产物先用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统中依据条带的亮度判断扩增产物的有无或扩增量的多少，然后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行不同个体的基因分型，明确判断不同个体在每个位点扩增等位基因的大小。

2.根据权利要求1所述的一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，其特征在于：步骤（3）中所述的PCR扩增体系为10×Buffer5μL，MgCl₂3μL25mM，dNTP1.0μL各含10mM，模板1μL100ng，SgSSR1017正反向引物各2μL，SgSSR0804正反向引物各1.5μL，SgSSR1123正反向引物各1μL，SgSSR1103正反向引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.4μL5U/μL，ddH₂O3.6μL。

3.根据权利要求2所述的一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，其特征在于：所述的10×Buffer5μL中含有200mM Tris-HCl pH8.8、25℃，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，1.0%Triton X-100。

4.根据权利要求1所述的一种大竹蛏微卫星标记的4重PCR检测方法，其特征在于：步骤（3）中所述的扩增程序为94℃变性5min后进行下面程序：94℃变性40S，45℃退火40S，65℃延伸1min20S，进行30个循环，最后65℃延伸7min。