[发明专利]一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法，本发明还涉及用于该检测的ELISA检测试剂盒。 

背景技术

Langedijk等研究发现，在CSFV的E^rns蛋白上存在一处抗原表位，该表位具有鉴别诊断功能，位于E^rns蛋白C末端191-227氨基酸处，它不仅能够将CSFV、BVDV、BDV区分开来，而且在未来的新型疫苗（以E2为目的蛋白）应用中，能够将疫苗免疫猪和野毒感染猪鉴别开，因此具有很好的应用前景。猪瘟病毒感染猪后能够诱导产生针对E^rns糖蛋白的抗体。E^rns糖蛋白的分子解析能够确定病毒感染后诱导产生的抗体，能够帮助设计有效的诊断抗原和疫苗。Lin等将猪瘟病毒Alfort/187多聚蛋白氨基酸序列297到776之间做缺失分析，Alfort/187多聚蛋白包括E^rns的C端(aa)27-227，整个E1蛋白(aa)1-195和E2蛋白N端(aa)1-87。不同缺失的基因片段连接于原核表达载体pET30，在原核细胞中表达，通过WesternBlot方法检测它们与猪瘟病毒感染猪血清的反应性，显示E^rns基因可以分为三个抗原区域：E^rns(aa)65-145、E^rns(aa)84-160和E^rns(aa)109-220。每一个独立的区域或包含这3个区域的片段，都能跟猪瘟病毒感染猪血清很好的反应。尽管不同的瘟病毒株E^rns基因内存在保守的或变异的区域，猪瘟病毒感染特异的血清学检测和瘟病毒感染的普遍性检测都能通过使用E^rns基因某一片段或多个片段的组合应用。 

当标记疫苗采用E2蛋白作为免疫原时，E^rns蛋白可以作为配套 的鉴别诊断试验的抗原来检测自然感染产生的抗体。最常用的检测CSFV抗体的方法所用抗原多为CSFVE2蛋白或浓缩纯化的细胞培养CSFV抗原，对于大多数比较成功的标记疫苗来说，这些方法大都不能作为配套的鉴别诊断实验。到目前为止，作为诊断抗原的E^rns(E0)蛋白都是由重组鸡痘病毒、昆虫细胞表达的或直接以合成肽的形式或用原核表达系统来表达的^【1-7】，成本较高，且产量方面也受到一定限制。 

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法。 

为实现上述目的，本发明首先提供E^rns蛋白体外表达方法，包括如下步骤：人工合成SEQIDNo.1所示序列的基因并克隆到毕赤酵母表达载体中得到重组表达载体，将重组表达载体转化毕赤酵母，筛选阳性克隆，培养并诱导表达，分离纯化得到E^rns蛋白。在本发明实例中所述毕赤酵母表达载体为pPIC9K，所述基因克隆到α因子信号肽序列下游；所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。 

进而本发明提供一种检测猪瘟病毒抗体的ELISA方法，包括如下步骤：将上述方法制备的E^rns蛋白作为抗原包被酶标板，将待测样品经稀释后加入酶标板温育，加入酶标二抗温育后显色。 

优选，所述抗原包被浓度为6.25μg/mL，包被条件为37℃，2h，再于4℃过夜。 

优选，待测样品为血清，按1:100稀释后加入酶标板，37℃温育1小时。 

优选，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，稀释10000倍后加入酶标板，37℃反应30min。 

当被检血清样品的OD₄₅₀≥0.38时，判为阳性；OD₄₅₀＜0.33判为阴性，介于两者之间的视为可疑，重检。 

本发明还提供一种猪瘟病毒ELISA检测试剂盒，其包括包被上述方法制备的E^rns蛋白的酶标板和选自以下试剂中的一种或多种：酶标二抗、稀释液、显色液、终止液、阳性标准品、阴性标准品。