[发明专利]一种带有双报告基因的登革病毒2型复制子的细胞系及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体涉及一种带有双报告基因的登革病毒2型复制子的细胞系，还涉及一种带有双报告基因的登革病毒2型复制子的应用。

背景技术

登革病毒（Dengue virus，DENV）属于黄病毒科黄病毒属成员，与其同属的成员还包括：日本脑炎病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒和黄热病毒等。其基因为单股正链RN A大小约为11kb，包括：3’非编码区，一个开放阅读框和5’非编码区。其中：3’非编码区和5’非编码区均含有保守的RNA序列和二级结构，其在病毒的复制和包装过程中发挥着重要作用；而开放阅读框则编码一个完整的多聚蛋白，在病毒编码的蛋白酶和来源于宿主的蛋白酶的作用下，该多聚蛋白被加工为3个结构蛋白(C、M和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。结构蛋白主要在病毒的组装过程中发挥重要的作用，而非结构蛋白主要参与病毒的复制。

作为一种重要的虫媒病毒，依据其抗原性，登革病毒分为4个血清型（DENV-1，2，3，4）。该病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊在人与人之间进行传播。该病毒在全球均有分布，主要包括：越南、新加坡、印度尼西亚、菲律宾、马来西亚、缅甸、印度尼西亚、美国、古巴、中国等，主要分布在热带和亚热带区域。据世界卫生组织的估计，全世界每年约有5千万至1亿人感染登革病毒而引发登革热，其临床症状主要表现为：发热、皮疹、头痛和肌痛；而登革病毒的感染者可能发展为更为严重的病症，即登革出血热和登革休克综合症，据统计每年全世界约有25万至50万人表现为登革出血热。目前还没有有效的疫苗和药物来预防和治疗登革病毒引起的疾病。历次登革病毒的爆发和流行给我国社会经济的发展带来了极大的影响，同时也给我国公共卫生体系的建设和运行带来了挑战。由于我国加强了登革病毒的传播媒介和病毒的监测、强化了媒介蚊虫的综合防治手段，城市卫生环境得到了改善，我国登革病例的报道相比以前已经减少，但是，随着全球气候的变化，城市化进程的加快、人员的频繁交往及我国在登革疫区劳务人员的增加，登革病毒流行的威胁依然存在，而且我国部分地区的气候和环境适合登革病毒的传播媒介的生存，为病毒的传播提供了条件。因此，加强登革病毒的监测、基础研究和抗病毒药物的开发具有十分重要的意义。

本发明提供了一种带有荧光素酶（Rluc）和新霉素磷酸转移酶（Neo）双报告基因的登革病毒2型（DENV-2）复制子稳定细胞系，该发明能够用于抗病毒的药物筛选、药物的作用机制、疫苗和诊断试剂等方面的研究，具有十分广泛的应用前景。

发明内容

本发明提供了一种带有双报告基因的登革病毒2型复制子的细胞系，该细胞系带有Rluc和Neo标签的登革热病毒2型复制子，革热病毒2型复制子在该细胞中能很好的复制，连续传代。该细胞系已于2011年12月20日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：含有登革病毒复制子的仓鼠肾传代细胞系BHK-21BHK-21/pACYC-TSV-Rluc2A-Rep-3NTR-IRES-Neo，CCTCC NO:C2011124，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了一种带有双报告基因的登革病毒2型复制子的细胞系的应用，该细胞系中Rluc编码的蛋白便于检测病毒基因组的复制，Neo基因编码的蛋白可使宿主细胞具有抗G418药物的能力，所述的应用包括该细胞系用于抗DENV病毒药物筛选、抗DENV病毒药物的作用机制、疫苗和诊断试剂等方面的研究，具有十分广泛的应用前景。

为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明的设计思路为：

在带有Rluc的DENV2质粒pACYC-DENV2-TSV-Rluc2A-Rep（Development and char acterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening[J].Antiviral r esearch,2011,91(1):11-19.）中插入IRES-Neo基因，构建带有Rluc和Neo基因的登革热病毒2型复制子，将该克隆体外转录的RNA转染入BHK-21细胞中，在合适浓度G418持续的抗性筛选下，经过连续传代筛选，最终获得了一种带有Rluc和Neo双报告基因的登革病毒2型（DENV-2）复制子的稳定细胞系。

一种带有双报告基因的登革病毒2型复制子的细胞系，其制备方法如下：

1）带有荧光素酶基因和新霉素抗性基因的登革热病毒2型复制子的构建，其方法如下：