[发明专利]耐高温植酸酶及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及耐高温植酸酶及其用途，属于生物技术领域。

背景技术

磷是动物必需的一种常量矿物元素，磷的添加对配合饲料生产成本及产品质量有重要影响。作为猪、禽饲料主要来源的玉米、豆饼粕、谷糠、棉籽饼粕等，它们所含的磷约40-70%以植酸磷的形式存在。而猪、禽等单胃动物，由于消化道内缺乏能分解消化植酸磷的微生物，仅能利用玉米种磷的10-20%、豆饼中磷的25-35%，典型猪日粮中磷的利用率只有15%，其余85%左右的磷从粪便中排出。因此，一方面为满足猪禽生长对磷的需要，必须在饲料中添加足够的无机磷酸盐，这样就增加了饲料成本；另一方面，粪便中排出的大量的磷又造成了对土壤和水源的污染。磷存在于土壤便面，不仅能在土壤中渗透和扩散，还会与铜、铝、钙等元素形成不溶性复合物而保留在土壤中。如果土壤中磷大量积聚并溢出，将随着土壤的侵蚀流动，造成自然界水体的污染。一些国家从环保的角度对集约化畜牧场已提出了限制排磷的要求。荷兰于1998年通过了MINAS（一种新的矿物元素结账系统）的立法，其中严格限制了动物粪便中磷酸盐的排放量。此外，植酸盐通过螯合作用还可降低动物对锌、锰、铁、钙、钾等主要微量元素的利用率，通过与蛋白质结合成植酸复合体而降低动物对蛋白质的消化吸收率，从而使整个饲料的利用率降低。

随着人们对绿色食品消费需求的增加和对畜牧业生产与过程中生态环境保护的重视，饲用酶制剂以其高效、安全、低成本等特点，已成为世界新型饲料添加剂研究和应用的热点。植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸水解酶（Myo-inositol hexaphosphate phosphohydrotase）,是催化植酸（即肌醇六磷酸）及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。大量研究表明，在猪、禽日粮中添加植酸酶，可使饲料中磷的利用率提高40-60%，粪便中磷的排出量减少30-50%左右。目前全世界已公认，要提高饲料中植酸磷的利用率，减少猪、禽粪便中植酸磷对环境的污染，降低植酸磷对其它微量元素及蛋白质利用率的影响，应用植酸酶是一种有效的方法。其中来源于无花果酶（A.ficuum）的植酸酶PhyA因其具备良好特性被认为是目前最有效的饲料用植酸酶。

作为用于饲料工业的酶制剂，由于饲料制粒工艺和动物生理生化的要求，真正得到推广利用的植酸酶必须是具有良好热稳定性，同时又必须在动物正常体温下具有较高的酶活性。如何解决使其耐短暂制粒高温、又能在动物正常体温下具有高酶活性这一对矛盾是目前包括植酸酶在内的所有饲用酶制剂均需解决的问题。此外，植酸酶催化的反应pH也必须与动物消化道相适应。不同的动物消化道的pH值不同，即使是一种动物在消化道的不同部位pH值也不同，一般的pH值胃为1.5-3.5，小肠为5-7、大肠为7左右，因此要求饲用酶对pH值有较大的适应范围。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种耐高温植酸酶。

本发明耐高温植酸酶的氨基酸序列如seq ID NO1所示。

其中，本发明还提供了所述的耐高温植酸酶用作饲料添加剂的用途。

另外，本发明还提供了含有上述植酸酶的饲料。

本发明植酸酶通过下述方法制备得到：

1、采用3D构建结合软件（Biosist和哥伦比亚大学自编的软件结合http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/servers/3dpssm/）预测，选择定点突变的氨基酸。采用软件预测技术，预测非保守区选择氨基酸的突变造成酶本身Tm值的变化，选择Tm值增大的氨基酸变化进行定点突变。通过对无花果曲霉（Aspergillus ficuum）植酸酶（EC3.1.3.26）非保守活性位点（1-33；361-441）进行系列定点突变，通过软件重建（Biosist和哥伦比亚大学的软件）发现27位氨基酸发生突变对Tm值影响最大，但对活性中心空间结构改变不明显。利用软件进行3D重建植酸酶解折叠温度，结果表明27位氨基酸由Gln突变为Gly后，其Tm值由72.5℃增加到83.3℃，且相对酶活力基本不变。

2、设计一对含预定突变的完全互补的寡核苷酸引物，突变碱基位于引物中央，两侧为10～15个正确的碱基；引物长度25～45个碱基，GC含量大于40%，3ˊ末端应为碱基G或C，Tm值不低于78℃。Stratagene公司给予上述原则开发出了在线的突变引物设计软件，与QuikChange^TMSite Directed Mutagenesis Kit配合使用。