[发明专利]一种新的贝壳烯酸‑13α‑羟化酶、其编码基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物工程领域，提供了一种新的甜叶菊来源的贝壳烯酸-13α-羟化酶(KAH)基因及在甜菊糖苷生物合成中的应用。

背景技术

随着肥胖和高血压等心血管疾病对人类健康的威胁加剧，人类对新型甜味剂的需求越来越迫切。甜菊糖苷是一种产自菊科植物甜叶菊(Stevia RebaudianaBertoni)中的二萜类糖苷化合物，具有高甜度、低热能的特点，其甜度是蔗糖的200-300倍，热值仅为蔗糖的1/300。甜菊糖在南美和东亚地区被广泛地作为药草和代糖已经有几百年历史，经常食用甜菊糖可预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病、龋齿等病症。随着欧美等国对甜菊糖安全性的逐渐认可，甜叶菊作为新型甜味剂和功能性食品添加剂将具有越来越大的市场。

目前有关甜菊糖苷生物合成途径研究相对比较清楚。作为典型的二萜类化合物，甜菊糖苷主要由萜类的通用前体——3个异戊烯焦磷酸(Isopentyl diphosphate，IPP)和1个二甲基丙烯基焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)单元经牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)，ent-柯巴基焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CDPS)，贝壳烯合成酶(Kaurene synthase，KS)形成二萜骨架贝壳烯。随后贝壳烯经两步细胞色素P450酶，即贝壳烯氧化酶(Kaurene oxidase，KO)和贝壳烯酸-13α-羟化酶(13α-kaurenoic acid hydroxylase，KAH)，分别在二萜骨架的C19和C13位形成羧基和羟基，形成重要中间体甜菊糖醇。最后甜菊醇经四步糖基化反应，最终形成甜菊糖莱鲍迪甙A(Rebaudioside A)，如图1所示。

目前甜菊糖合成途径中所有酶的基因均已经获得了报道，并为植物细胞遗传改造提高甜菊糖产量和微生物异源合成甜菊糖苷的研究打下了基础。作为催化贝壳烯酸到甜菊醇的第二个细胞色素P450酶KAH，虽已经有多个甜叶菊来源的序列被报道，而且部分序列已经在植物中过表达以改善甜菊糖苷合成或酵母细胞中进行生物转化研究，但其目前仍是甜菊糖生物合成的限速步骤，而且仍然未有能够在原核宿主中活性表达KAH的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的贝壳烯酸-13α-羟化酶、其编码基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的贝壳烯酸-13α-羟化酶，其选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的蛋白片段；或

(d)具有(a)多肽功能的且与(a)多肽具有90%以上(较佳地95%以上；更佳地98%以上；更佳地99%以上)氨基酸序列相同性的多肽。

在一个优选例中，所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶来源于甜叶菊。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码如所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶。

在一个优选例中，提供该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示(密码子优化序列)。

在本发明的第一方面，提供一种重组载体，它含有前面任一所述的多核苷酸。

在本发明的第一方面，提供一种宿主细胞，它含有所述的重组载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。