[发明专利]一种高效分泌表达纳豆激酶的重组菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组菌，特别涉及一种能够高效分泌表达纳豆激酶的重组菌。

背景技术

纳豆激酶（Nattokinase，NK）是一种在纳豆发酵过程中由纳豆菌或纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）产生的丝氨酸蛋白酶。1980年，日本须见洋行教授首先发现该酶能溶解人造血栓，而后研究了该酶的作用机理，并将其命名为纳豆激酶。

从1995年国内第一篇有关纳豆和纳豆激酶的报道以来，至今已有多篇文章发表，而且研究与开发同时并进。目前对纳豆激酶的性质（纳豆激酶基因序列、蛋白质氨基酸序列、活性中心及催化中心、pI、温度及pH稳定性，最适反应温度及pH、抑制剂及激活剂以及纳豆激酶的溶栓机制包括①纳豆激酶的直接溶栓作用；②激活尿激酶原变成尿激酶；③激活血管内皮细胞产生t-PA；④纳豆激酶的间接溶栓作用，通过降解和失活PAI-1，增加纤溶作用等均已阐明，而且已对该酶进行了分离纯化，在体内外溶栓动物试验、急性毒性试验及治疗脑梗塞的初步临床试验等方面进行了大量研究工作。

目前，纳豆激酶在日本已得到广泛深入的研究，日本已有10余家大公司生产出多种以纳豆激酶为主要成分的产品均已经上市，美国国际医卫生技术制药股份有限公司的纳豆激酶胶囊也已面市，韩国和朝鲜也有类似产品问世。在我国，已有多家厂商生产纳豆激酶胶囊制品，但由于生产菌株产量过低致使市售纳豆激酶保健品与日本进口产品相比，活力单位相差很大。因此有必要对纳豆激酶生产菌株进行改造，以大幅增加菌株产量，提高最终产品品质。

与传统育种相比，依靠基因工程手段，用模式宿主如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母以及毕赤酵母等来生产重组纳豆激酶是短时间内提高纳豆激酶产量的捷径。目前为止，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母表达的纳豆激酶的案例都不是很成功。近些年，毕赤酵母以其安全、高效分泌表达，在医药和重要食品酶制剂的表达上取得了越来越多的应用，因此，使用毕赤酵母来生产纳豆激酶将是最具有应用前景的方法之一。目前已有一些用毕赤酵母表达纳豆激酶的报道，罗立新等人将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母GS115，KM71中表达成功，发酵上清液中的酶活力为120U/mL（黄志立，罗立新，凌均建等.纳豆激酶基因重组表达载体的构建及其稳定性［J］.广东药学院学报，2000，16(4):265-267）。王江波等将纳豆激酶全肽基因在毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168中成功表达并比较分析（汪江波，许芳，张婧芳.纳豆激酶原基因在毕赤酵母中的分泌表达［J］.中国酿造，2008，19(196):40-41）。蔡立涛等将NK基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A中，甲醇诱导表达，结果SDS-PAGE结果显示NK成功表达，纤维蛋白平板实验显示表达产物具有较好的纤溶活性（蔡立涛，徐祥，王婷婷等.纳豆激酶基因在毕赤酵母中的表达纯化及抗体制备［J］.中国生化药物杂志，2010(1)）。但是上述文章中纳豆激酶的表达水平仍然无法满足产业化的需求，仍需要对于生产菌株做进一步的优化和提升。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够高效分泌表达纳豆激酶的重组菌。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

纳豆激酶Pro-NK基因的重组载体，该重组载体是将两个以上的纳豆激酶Pro-NK基因插入真核表达载体后得到的。

进一步的优选的重组载体是将两个以上的纳豆激酶Pro-NK基因同向插入真核表达载体后得到的。

上述纳豆激酶Pro-NK基因的编码序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

每个纳豆激酶Pro-NK基因具有一个与其相应的启动子。

上述启动子为醇氧化酶I启动子（P_AOX1）或甲醛脱氢酶启动子（P_FLD1）。

优选的纳豆激酶Pro-NK基因的重组载体，选用的真核表达载体为pAO815表达载体；该pAO815表达载体是通过将pPICZα载体用SacI和EcoRI进行双酶切得到的1000bp片段与同样用SacI和EcoRI消化过的pAO815载体连接所得到；每个纳豆激酶Pro-NK基因处于一个与其相应的醇氧化酶I启动子之下表达，相邻的纳豆激酶Pro-NK基因之间依次串联有醇氧化酶I终止子、醇氧化酶I启动子与α-mating因子信号肽序列。

该重组载体是按以下方法构建而得：