[发明专利]双管式单分子微流装置

说明书

技术领域

本发明提供一种双管式单分子微流装置，属于单分子分析技术领域。

背景技术

蛋白质纳米通道（纳米孔）单分子分析技术是以蛋白质纳米通道/纳米孔（包括天然、基因工程化和化学目标修饰的蛋白质离子通道）为分析元件，借助电化学方法测量分析物通过通道时离子电流（pA级）的变化而建立的单分子分析方法。相比其它单分子分析方法如原子力显微镜（AFM）和单分子荧光分析等，这种方法简单、快速，无需标记，无需其它昂贵试剂和仪器以及复杂的样品处理。由于不同分子大小和电荷不同，产生的信号（电流大小和滞留时间）不同，这种方法可用于多混合物的分析。此外，蛋白质分子结构和孔大小确定，很容易进行原子精度的位点修饰、功能化和组装而提高分析的选择性。由于上述优点，近年来这种单分子分析技术得到了快速发展，已应用于检测金属离子及阴离子、研究 DNA 损伤、分析单个多肽结构及蛋白质构型、探测识别单个 DNA 与靶分子间相互作用、检测有机小分子化合物, 并有望实现基于单分子水平的 DNA 测序。

目前，在蛋白质纳米通道（纳米孔）单分子分析技术装置方面，普遍采用的是有两个反应室的静态开式电解池。在这个装置中，两个反应室之间夹有带一小孔的聚四氟乙烯膜，使小孔成为两个室之间的唯一通路，垂直的平面脂双层膜可形成于小孔上，蛋白质通过自组装，在脂双层膜上形成蛋白纳米通道。分别置于两个反应室的银/氯化银(Ag/AgCl)电极可检测蛋白纳米通道之间的电流。基于这种装置的蛋白质纳米通道单分子分析技术在检测方法上较为单一，且很难实现小型化、阵列化、自动化及样品的微量化。

发明内容

本发明将蛋白质纳米孔单分子检测技术与微流控技术相结合，提供一种体积小，重量轻，便于携带，易实现自动化，蛋白质、样品与试剂使用的微量化，省时，经济，重复使用稳定性好的双管式单分子微流装置；

本发明还提供所述装置中特氟龙软管管壁上微米级小孔准确、可控的电火花打孔制作技术；

本发明还提供在所述装置的微流通道中组装脂双层膜的方法；

本发明还提供在所述装置的微流通道中组装嵌有单个蛋白纳米通道的脂双层膜的方法；

本发明还提供利用所述装置进行单分子检测的方法。

本发明实现过程如下：

一种双管式单分子微流装置，其特征在于：所述装置由两个不同直径大小的内管和外管组装成同心套管结构，内管管壁上有微孔，内管和外管上分别设有进液口、出液口和电极连接口；所述微孔尺寸为10 ~200μm，微孔上组装有脂双层膜，脂双层膜上有蛋白质纳米通道。

上述双管式单分子微流装置中外管为玻璃管；内管为带有微孔的特氟龙软管；外管上端的T型三通接头连接电极和作为外管液体出口；外管下端的T型三通接头用于连接内管和侧面的T型三通接头；内管下端的小的T型三通接头用于连接内外管、连接电极以及作为内管进液口；侧面小的T型三通接头用于连接电极以及作为外管进液口。

上述的双管式单分子微流装置的加工方法，包括以下步骤：

（1）采用电火花打孔装置在内管管壁上制作微孔；

电火花打孔装置包括一个火花发生器和两个铂丝电极，其中一个电极水平置于内管内部，另一个电极置于内管外部且垂直内部电极，两个电极尖端对齐，并相距一定距离，采用电火花制作10 ~200μm的微孔；

（2）连接内管与外管。

上述双管式单分子微流装置中脂双层膜在微孔上的组装方法：将缓冲液注入内管和外管，且液面低于内管管壁上的微孔，在内外管液面上分别滴加溶于有机溶剂的磷脂，磷脂分子平铺于有机试剂-溶液界面形成磷脂单分子层；推动缓冲液，使其没过内、外管管壁上的微孔，两管液面上的磷脂单分子层在微孔处形成脂双层膜；通过光学显微技术监测磷脂双层膜的形成，或在内外腔分别连接电极，通过膜片钳放大器记录电信号以监测脂双层膜的形成。

上述双管式单分子微流装置中蛋白质纳米通道在脂双层膜上的组装方法：在已形成脂双层膜的微流控装置的内管或外管中加入跨膜蛋白质，使跨膜蛋白质自组装于脂双层膜上形成单个蛋白质纳米通道，然后推动外管缓冲液，以避免出现多个蛋白质通道，通过膜片钳放大器记录电信号监测蛋白质纳米通道的形成。

上述双管式单分子微流装置可应该有在微流系统的单分子检测中。具体地说，在形成单通道的情况下，将适配体β环糊精加入到反式腔室，β环糊精自组装于蛋白质纳米通道内，造成一定的阻塞，改变了通道电流值的大小；再将生物素分子加入到顺式腔室，在环糊精造成的电流阻塞基础上出现二次电流阻塞水平台，由此可实现对生物素的单分子随机识别。