[发明专利]一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法及应用

权利要求书

1. 一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法，分别由集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P-SSM2中克隆出藻类红色素合成关键酶基因（血红素氧化酶基因hox1和藻类红色素藻类红色素合成酶基因pebS），采用多基因组合表达方法，将该两基因导入大肠杆菌中，以大肠杆菌自身血红素为底物，通过Hox1和PebS两步酶促催化反应，在受体细胞中建立重组藻类红色素的生物合成途径，从而获得相应的大肠杆菌重组工程菌株，并应用此工程菌株生产重组藻类红色素，其制备步骤：

（1）根据Genebank中公布的集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803血红素氧化酶基因hox1和Prochlorococcus phage P-SSM2藻红素合成酶基因pebS的基因序列，设计适当引物，分别以集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P-SSM2基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻类红色素合成关键酶基因hox1和pebS；

（2）采用多基因组合表达方法将上述步骤（1）克隆得到的藻类红色素合成关键酶基因hox1和pebS重组到适当表达载体上，并将此构建重组表达载体转入大肠杆菌中，得到大肠杆茵工程茵株；

（3）将上述步骤（2）所得到的大肠杆菌工程菌株在37℃培养至OD₆₀₀＝0.5~0.7菌体浓度后，降温至25℃，利用IPTG作为诱导剂进行诱导，继续避光培养24小时，离心收集菌体；

（4）将上述步骤（3）收集到的菌体用甲醇悬浮萃取2小时，离心分离后，上清液即得藻类红色素粗提液，将藻类红色素粗提液与等体积的氯仿混合，萃取出多余的蛋白质，然后再经制备型HPLC进一步精制，得到高纯度的藻类红色素，将藻类红色素溶液冷冻干燥或旋转蒸发除去多余水分，即得高纯度藻类红色素粉末产品。

2. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的血红素氧化酶基因hox1是指与Synechocystis sp. PCC 6803中sll1184基因同源的基因；藻类红色素合成酶基因pebS是指与Prochlorococcus phage P-SSM2中YP_214290.1基因同源的基因。

3. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的表达载体是大肠杆菌E. coli的pET28a、pETDuet-1，pCDFDuet-1等多基因共表达载体系列。

4. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的设计适当引物是根据Genebank中所公布的hox1和pebS基因序列设计引物，hox1的正向引物P1：5’-TAGGATCCTATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG-3’，反向引物P2: 5’-TTGAGCTCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG-3’；pebS的正向引物P3：5’-TTCATATGATGACGAAGAACCCGCG-3’，反向引物P4: 5’-TGCTCGAGTTACTTGTAGGAGAACAG-3’。

5. 根据权利要求1所述的制备藻类红色素的方法，其特征在于所述的多基因组合表达方法是指多基因组合表达工程方法，在hox1基因两端分别加上BamH I和Sac I酶切位点，并插入到pET28a、pETDuet-1、pCDFDuet-1质粒的第一个多克隆位点处，得到重组载体；在基因pebS两端分别加上NdeⅠ和Xho I酶切位点，并插入到pET28a-hox1、pETDuet-hox1、pCDFDuet- hox1质粒的另一个多克隆位点处，得到重组载体。