[发明专利]核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用

权利要求书

1.一种核酸适配体，其特征是，所述核酸适配体为

a：5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，

所述X为5’-TGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGG-3’、

5’-TGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGA-3’或

5’-TAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTG-3’；

b：与a所述核酸适配体具有60%以上同源性且具有检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞功能；

c：在严紧条件下，与a或b的序列进行杂交的序列；或

d：a、b或c的核酸适配体序列转录的RNA序列。

2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征是，所述核酸适配体在保持整体结构不变的前提下，所述核酸适配体的核苷酸序列上的任一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。

3.一种核酸适配体衍生物，其特征是，所述核酸适配体衍生物为如权利要求1或2的所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯衍生物或核酸适配体的相对应的肽核酸。

4.一种如权利要求1或2的核酸适配体的筛选方法，其特征是，包括以下步骤，

1、合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机单链DNA文

库:5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，

5’端引物：5’-FAM-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGC-3’，

3’端引物：5’-Biotin-CGTCAGGTTCAGTCAGCAGG-3’，和

链酶亲和素修饰的琼脂糖微球；

2、cell-SELEX筛选

2.1使无关序列和人鼻咽癌细胞株CNE2细胞接触，得到预处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞；

2.2使随机单链DNA文库和预处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞接触，孵育，得到处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞；

2.3将上述步骤2.2得到的处理后的人鼻咽癌细胞株CNE2细胞和单壁碳纳米管接触，筛选，得到CNE2细胞的特异核酸适配体文库；

3、对步骤2的CNE2细胞的特异核酸适配体文库进行PCR扩增，得到扩增的双链DNA；

4、将步骤3的扩增的双链DNA和链酶亲和素修饰的琼脂糖微球接触，孵育，分离，变性处理，分离，得到单链DNA文库；

5、阴性筛选：使无关序列和人鼻咽癌细胞株HONE细胞接触，得到处理后的人鼻咽癌细胞株HONE细胞；将步骤4得到的单链DNA文库和处理后的人鼻咽癌细胞株HONE细胞接触，收集细胞接触后的溶液；

6、多轮筛选：将步骤5得到的细胞接触后的溶液替代步骤2的随机单链DNA文库，重复步骤2-5至少一次，分析，确认，得到所述核酸适配体。

5.如权利要求4所述的筛选方法，其特征是，所述步骤4的所述变性处理，分离的方法是，加入强碱性溶液，离心，收集上清液，将上清液过除盐柱后收集滴下的溶液，得到单链DNA文库。

6.如权利要求4所述的筛选方法，其特征是，所述步骤6中，分析，确认的方法为，在步骤2得到的CNE2细胞的特异核酸适配体文库中加入胎牛血清，使用流式细胞仪监测单链DNA文库对人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的识别能力，测序，富集度高的为所述核酸适配体。

7.如权利要求1或2所述的核酸适配体、权利要求3所述的核酸适配体衍生物或权利要求4-6所述的筛选方法得到的核酸适配体在检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞中的应用。

8.如权利要求1或2所述的核酸适配体、权利要求3所述的核酸适配体衍生物或权利要求4-6任一项所述的筛选方法得到的核酸适配体在制备检测人鼻咽癌细胞株CNE2细胞的试剂盒中的应用。